2株B型副雞禽桿菌的分離鑒定

楊國良，鄭 杰，張 洪，龍進學(xué)，張發(fā)明，張 坦，孫豐廷，鄧秋紅，張 紅，王文泉

(北京華都詩華生物制品有限公司，北京 102600)

雞傳染性鼻炎(Infectious Coryza，IC)是由副雞禽桿菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)引起雞的一種急性呼吸道疾病，該病可使育成雞生長發(fā)育不良和產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋明顯下降(可引起產(chǎn)蛋率下降10% ～40%)［1］。在我國主要發(fā)生在北京、西安等一些北方的養(yǎng)殖場，在南方很少有報道［2］。其主要特征是發(fā)病率高而死亡率低，但飼養(yǎng)環(huán)境惡劣、寄生蟲、營養(yǎng)不良或伴發(fā)其他疾病，如禽痘、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎等，可使傳染性鼻炎的病情加重，持續(xù)時間會更長，引起死亡率增加［3－4］。由于康復(fù)的帶菌雞是主要的傳染源，所以不提倡從不明來源的地方購買種公雞和開產(chǎn)雞的習(xí)慣做法，除非知道雞群來源于無傳染性鼻炎雞場，否則只應(yīng)購買1日齡雞作為后備雞。預(yù)防和控制本病的理想措施是遠離老雞群進行隔離飼養(yǎng)。要從雞場中徹底消除病原，必須首先清除感染雞或康復(fù)雞，對禽舍和設(shè)備進行清洗和消毒后，在重新飼養(yǎng)清潔雞之前，禽舍應(yīng)空閑2～3周。

按照Page平板凝集試驗的分型方法，副雞禽桿菌可分為A、B和C三個血清型。各型之間不產(chǎn)生交叉保護［5］，一種血清型制備的菌苗免疫雞，只能對同源菌的攻擊提供保護。2003年張培君等在遼寧首次分離到了B型副雞禽桿菌［6］，結(jié)合本次北京所分離到的2株B型副雞禽桿菌，說明我國B型Apg的存在已經(jīng)不局限于某地的暴發(fā)，而是有蔓延的趨勢。這就要求現(xiàn)階段養(yǎng)殖戶在免疫時有必要將傳染性鼻炎疫苗與目標(biāo)雞群中存在的血清型相匹配，這樣才能達到最理想的免疫效果，從而防止蔓延?；诖耍覈鴳?yīng)該積極研制B型副雞禽桿菌的單苗或聯(lián)苗，以打破國內(nèi)以A型、C型單雙價滅活疫苗為主的格局。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 C－Apg－8(Page A型)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1．1．2 鼻炎疫苗 雞傳染性鼻炎(A型)滅活疫苗由北京華都詩華生物制品有限公司提供。

1．1．3 培養(yǎng)基 雞肉湯培養(yǎng)基、雞肉湯瓊脂、半合成培養(yǎng)基參照馮文達等的方法制備［7］。

1．1．4 主要試劑及試劑盒 DNA Marker、DNA聚合酶、dNTPs，TaKaRa公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純，均由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供。

1．1．5 病料信息 病雞來源于北京平谷和延慶某公司雞場，具有雞傳染性鼻炎的臨床癥狀。主要表現(xiàn)為臉部腫脹，鼻孔有粘性分泌物流出，有時打噴嚏，食欲及飲水減少，體重減輕，精神沉郁，縮頭，呆立。6 d內(nèi)蔓延全群，85%的雞出現(xiàn)癥狀。

1．2 方法

1．2．1 菌株分離 將具有典型臨床癥狀的病雞處死，雞頭表面消毒，無菌切開眶下竇，用接種環(huán)蘸取眶下竇內(nèi)容物，在含有NAD(輔酶Ⅰ、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的雞血清瓊脂平板上劃線，同時接種普通肉湯和普通瓊脂平板作為對照，然后將平皿倒置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～20 h，挑取單個可疑菌落進行純培養(yǎng)，同時將純培養(yǎng)產(chǎn)物作為研究對象，進行下一步鑒定。

1．2．2 無雜菌檢驗 將北京平谷、延慶所分離的可疑菌落純培養(yǎng)物接種葡萄糖蛋白胨(GP)、酪胨瓊脂(GA)斜面、硫乙醇酸鹽(TG)小管各2支，每支0．2 mL，其中1支置37℃培養(yǎng)，1支置25℃培養(yǎng)，觀察3～5 d。

1．2．3 過氧化氫酶試驗 挑取典型的菌落進行過氧化氫酶試驗，如有氣泡即為陽性反應(yīng)。

1．2．4 種子液活菌計數(shù)方法 采用微量點板計數(shù)法。選擇適宜的四個稀釋度，每個稀釋度接種2點，接種量為10μL，接種含有NAD的雞血清瓊脂平板使其自然擴散。于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h(37℃、5%CO2)。依照 GB4789．2－94中的方法開展活菌計數(shù)。

1．2．5 PCR鑒定方法 按常規(guī)方法處理細菌培養(yǎng)物，將上述培養(yǎng)物取2μL作為模板，進行 PCR。PCR程序參照陳小玲等的方法進行:98℃變性2．5 min。反應(yīng)過程為94℃ 1 min，65℃ 1 min和72℃2 min，循環(huán)25次，然后94℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 10 min循環(huán)1次。PCR產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳分析［8］。

1．2．6 引物合成 根據(jù)陳小玲等發(fā)表文章中已知的引物序列［9］，由Invitrogen北京分公司合成。上游引物P1:5’－TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT－3’;下游引物 P2:5’－ CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT －3’。

1．2．7 回歸試驗 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的新鮮菌液，經(jīng)過活菌計數(shù)并且將其稀釋至規(guī)程要求的范圍，眶下竇接種70日齡的SPF雞，其中試驗組和對照組分3個隔離器飼養(yǎng)，接種后逐日觀察其臨床表現(xiàn)。試驗情況見表1。

表1 攻毒情況記錄表

1．2．8 免疫攻毒試驗 取60～90日齡SPF雞28只，其中免疫組、對照組在分別接種A型鼻炎疫苗、PBS 30 d后各眶下竇內(nèi)注射平谷株、延慶株以及A型細菌培養(yǎng)物，分5個隔離器飼養(yǎng)，觀察14 d，試驗情況見表2。

表2 免疫攻毒情況記錄表

1．2．9 水平傳播試驗 取60～90日齡SPF雞40只，其中6只一組(3只作為攻毒組，3只作為PBS對照組)，14只一組(3只作為攻毒組，11只作為PBS對照組)，分別放入飼養(yǎng)面積相同的1～4號隔離器中飼養(yǎng)。每組雞按要求各眶下竇內(nèi)接種平谷株、延慶株細菌培養(yǎng)物，接種后逐日觀察其臨床表現(xiàn)，試驗情況見表3。

表3 Apg水平傳播試驗記錄表

1．2．10 分離菌株血清型鑒定 將菌株用20%甘油保存，送匈牙利詩華研發(fā)中心代為鑒定。

1．2．11 序列測定與分析 從瓊脂糖中回收PCR產(chǎn)物目的片段，用雙脫氧法直接對PCR產(chǎn)物進行測序，為了保證序列準(zhǔn)確性，同時反向測定序列加以驗證。并將所測定的2株B型副雞禽桿菌基因序列與NCBI基因庫中參考株(GenBank登錄號:DQ132874．1)相應(yīng)序列進行比較分析。

2 結(jié)果

2．1 細菌分離及初步鑒定 從平谷、延慶可疑病雞眶下竇內(nèi)各分離到1株細菌，此菌在含有NAD的雞血清瓊脂平板上形成邊緣整齊、半透明露滴狀的小菌落，在普通肉湯和普通瓊脂平皿上不生長。挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡下可見兩級濃染的革蘭氏陰性短桿菌。過氧化氫酶試驗結(jié)果均為陰性，無雜菌檢驗顯示葡萄糖蛋白胨(GP)、酪胨瓊脂(GA)斜面上均無菌生長，硫乙醇酸鹽(TG)小管有輕微細菌生長。

2．2 PCR反應(yīng)結(jié)果 如圖1所示，平谷、延慶菌株與標(biāo)準(zhǔn)陽性對照菌株、陰性對照一起，經(jīng)PCR儀按照設(shè)定程序擴增后，經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳25 min，結(jié)果顯示分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)陽性對照菌株均在0．5 kb位置出現(xiàn)了大小相同的DNA條帶，與預(yù)期的擴增片段大小一致。

圖1 分離菌株的PCR鑒定結(jié)果

2．3 回歸試驗 用平谷、延慶分離菌株人工感染SPF雞24 h后均出現(xiàn)食欲減退、眶下竇及臉部嚴重腫脹、呆立、鼻孔有粘液流出等典型的IC臨床發(fā)病癥狀。在感染雞的眶下竇內(nèi)又重新分離到了副雞禽桿菌菌落。剖檢病變主要為兩側(cè)眶下竇內(nèi)有粘液樣物質(zhì)分泌，眼結(jié)膜充血。接種PBS的對照雞，至觀察結(jié)束未出現(xiàn)IC發(fā)病癥狀。

2．4 免疫攻毒試驗 副雞禽桿菌平谷株對照組4/4發(fā)病，免疫組1/8保護為不合格;延慶株對照組4/4發(fā)病，免疫組0/8保護為不合格(根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》:對照組4/4發(fā)病，免疫組6/8保護為合格。對照組3/4發(fā)病，免疫組7/8保護為合格)。而接種A型疫苗+A型菌液的對照組100%保護(4/4)。

2．5 水平傳播試驗 1、3號隔離器中的攻毒組3/3發(fā)病，對照組至觀察結(jié)束未見IC發(fā)病癥狀。2、4號隔離器中的攻毒組3/3發(fā)病，對照組在攻毒后第5天相繼出現(xiàn)了食欲減退、臉部腫脹、流鼻涕、打噴嚏等IC發(fā)病跡象。隨后對2、4號隔離器中對照組雞進行細菌的分離培養(yǎng)及PCR檢測鑒定，證明所分離到的菌株為副雞禽桿菌。

2．6 血清型鑒定結(jié)果 將所分離到的平谷株、延慶株Apg經(jīng)匈牙利詩華研發(fā)中心代為鑒定，其結(jié)果為B型副雞禽桿菌。

2．7 序列測定與分析結(jié)果 經(jīng)序列測定，克隆的PCR產(chǎn)物長度為500 bp，與預(yù)期的擴增片段長度相符。應(yīng)用DNASTAR軟件進行基因核苷酸序列遺傳距離分析，結(jié)果顯示平谷株、延慶株基因序列同源性達到99．6%，而與 NCBI基因庫中參考株(GenBank登錄號:DQ132874．1)Modesto的基因序列同源性達到98．3%、98．8%，結(jié)果見圖2。

圖2 B型副雞禽桿菌基因核苷酸序列遺傳距離分析結(jié)果

3 討論

3．1 本試驗中分離菌在含NAD的雞血清瓊脂平皿上呈露滴狀生長，在普通肉湯和普通瓊脂平皿上不生長;革蘭氏染色為陰性短桿菌，兩極濃染;過氧化氫酶試驗結(jié)果為陰性;無雜菌檢驗顯示在GA、GP上均無菌生長，但在TG小管中有輕微細菌生長;將分離菌人工感染SPF雞24 h后均出現(xiàn)眶下竇及臉部嚴重腫脹、食欲減退、呆立、鼻孔有粘液流出等典型的IC臨床發(fā)病癥狀，同時在感染雞的眶下竇內(nèi)又重新分離到了副雞禽桿菌;在PCR結(jié)果陽性的基礎(chǔ)上，用已知Apg A型鼻炎滅活疫苗免疫SPF雞后接種平谷、延慶分離菌株，均不能保護，而接種A型菌株的對照組100%保護(4/4)證明所分離到的Apg肯定不是A型。為了進一步驗證分離物，將分離到的Apg送匈牙利詩華研發(fā)中心代為鑒定。鑒定結(jié)果與攻毒保護試驗結(jié)果一致，可以判定該分離物為B型副雞禽桿菌，暫命名為副雞禽桿菌平谷株和延慶株。

3．2 雞傳染性鼻炎傳播途徑主要以飛沫及塵埃經(jīng)呼吸傳播，本次傳播試驗中，使用相同面積飼養(yǎng)的1、3號隔離器內(nèi)的6只雞沒有發(fā)生水平傳播現(xiàn)象，而2、4號隔離器內(nèi)的14只雞在攻毒后第5天相繼出現(xiàn)了精神沉郁、食欲減退、鼻孔有粘性分泌物流出、臉部腫脹、打噴嚏、縮頭、呆立等IC發(fā)病跡象。由此可見，本病的發(fā)生和反復(fù)發(fā)作與飼養(yǎng)密度有很大的關(guān)系。

3．3 由免疫攻毒試驗得知，傳染性鼻炎A型滅活疫苗免疫過的SPF雞對平谷、延慶分離菌株的攻擊沒有起到保護作用，此結(jié)果與該菌株的血清型的鑒定結(jié)論一致。由于滅活的雞傳染性鼻炎疫苗只提供針對疫苗中含有的Page血清型的保護，因此菌苗中關(guān)鍵要含有目標(biāo)雞群中存在的血清型。Page B型已經(jīng)證實是一種真正存在的具有完全致病性的血清型，并且發(fā)生很廣，這就是說，在存在血清型B的地區(qū)使用的滅活菌苗中必須含有這一血清型。然而，由于血清型B的不同菌株間只能提供部分交叉保護［10］，因此在血清型B流行的地區(qū)有必要加快雞傳染性鼻炎多價疫苗的研究。

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