微載體灌注培養(yǎng)Marc－145細(xì)胞制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗

楊 雷，李 偉，漆世華，秦紅剛，韓 興，謝紅玲，溫文生，吳玉石

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病［1］。該病于 1987年最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)［2］。1991年，荷蘭中央獸醫(yī)研究所確定該病的病原是一種新的RNA病毒，并命名為L(zhǎng)elystad病毒［3－4］。1996 年郭 寶清 等［5］首 次 從 國(guó) 內(nèi)疑 似PRRS感染豬群中分離出PRRSV，從而證實(shí)了本病在我國(guó)的存在。2006年4月［6］我國(guó)豬群暴發(fā)了高致病性繁殖與呼吸綜合征，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征是由高度變異的PRRSV引起的豬的烈性傳染病，是我國(guó)新出現(xiàn)的重大動(dòng)物疫病，已成為當(dāng)前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一。

我國(guó)目前控制PRRS的主要方法是使用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，高滴度的病毒液是疫苗生產(chǎn)中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。目前國(guó)內(nèi)Marc－145細(xì)胞制備PRRS疫苗均采用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝，由于存在瓶與瓶之間細(xì)胞密度不整齊、勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)成本高，且操作過(guò)程易污染等缺點(diǎn)，自2012年2月1日起，農(nóng)業(yè)部已停止受理轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式的的獸用細(xì)胞苗生產(chǎn)線項(xiàng)目獸藥GMP驗(yàn)收申請(qǐng)。因此，傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝的應(yīng)用必將越來(lái)越受到限制。自20世紀(jì)60年代微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)建立以來(lái)，國(guó)外許多國(guó)家對(duì)其在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛研究，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)已是當(dāng)前國(guó)際上生物制品生產(chǎn)的主流模式［7］。在國(guó)內(nèi)利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫病毒，其抗原含量比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)提高10倍以上，疫苗的不良反應(yīng)得到進(jìn)一步改善［8］。利用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)Marc－145細(xì)胞繁殖PRRSV具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如提高生產(chǎn)能力，減少對(duì)勞動(dòng)力的需求，降低污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)通過(guò)灌注培養(yǎng)不斷更換培養(yǎng)基，提供充足的營(yíng)養(yǎng)成分且?guī)ё叽x產(chǎn)物，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，大大提高了細(xì)胞的生長(zhǎng)密度，從而可以獲得較大量高滴度的PRRSV。本實(shí)驗(yàn)對(duì)生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于PRRS疫苗生產(chǎn)作了進(jìn)一步研究，取得了很好的效果。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞 病毒培養(yǎng)用Marc－145細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，將該細(xì)胞連續(xù)傳30代進(jìn)行致腫瘤實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果為陰性。細(xì)胞培養(yǎng)液為含8%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(清大天一，批號(hào)110405)。

1．2 毒種 生產(chǎn)用毒種為PRRSV PC弱毒株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和中博生物股份有限公司構(gòu)建的基因工程疫苗株，病毒維持液為含1%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM。攻毒用毒株為PRRSV GD第5代毒株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所分離鑒定并提供。

1．3 微載體 微載體為Cytodex－1(Pharmacia)。Cytodex－1水化處理方法是用無(wú)鈣鎂離子的PBS溶液洗滌2次，37℃浸泡2 h，121℃高壓滅菌30 min，置4℃貯存待用，使用前用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌2次。

1．4 生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng) 分別用1×104/mL和1×105/mL濃度的Marc－145細(xì)胞接種于NBS310型生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體培養(yǎng)。培養(yǎng)體積10 L，微載體濃度10 g/L，控制pH在7．2，溫度為37℃，溶解氧(DO)值設(shè)為50，攪拌速度為30～50 r/min。培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)程中監(jiān)測(cè)葡萄糖含量，每天取樣檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)葡萄糖的消耗量和細(xì)胞生長(zhǎng)情況調(diào)節(jié)灌注速度。

1．5 疫苗制備 細(xì)胞培養(yǎng)至一定密度后，開(kāi)始灌注維持液，當(dāng)灌注2個(gè)工作體積后接種病毒，停止灌注，進(jìn)行病毒吸附，2～3 h后開(kāi)始灌流收獲病毒液，每天取樣測(cè)定病毒滴度。在測(cè)定的病毒含量大于106．0TCID50/mL病毒液中加入適量的凍干保護(hù)劑，經(jīng)冷凍干燥制備試驗(yàn)疫苗，進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。

1．6 病毒含量測(cè)定 將不同時(shí)間段收獲的病毒液用無(wú)血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液作10倍系列稀釋，取10－3、10－4、10－5、10－64 個(gè)稀釋度，分別接種已長(zhǎng)成良好單層、棄去細(xì)胞培養(yǎng)液的96孔Marc－145細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度接種6孔，每孔0．1 mL，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，每孔補(bǔ)加含4%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液0．1 mL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察5 d，根據(jù)Reed－Muench法計(jì)算TCID50。

1．7 效力測(cè)定 將懸浮培養(yǎng)的3批PRRSPC株病毒液制備成活疫苗，每批分別免疫28日齡PRRS抗原抗體雙陰健康仔豬5頭，免疫劑量1頭份(每頭份病毒含量≥105．0TCID50)，頸部肌肉注射，免疫28 d后連同未免疫對(duì)照豬一起，用PRRSV GD第5代毒株105．0TCID50/mL攻毒，頸部肌肉注射3 mL/頭豬，效力檢驗(yàn)結(jié)果以攻毒后臨床觀察及體溫測(cè)定結(jié)果，21 d后剖檢肺部出現(xiàn)的實(shí)質(zhì)性病理變化或死亡等指標(biāo)為發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算保護(hù)率。

2 結(jié)果

2．1 不同細(xì)胞接種濃度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響 分別用1×104/mL和1×105/mL的細(xì)胞濃度接種反應(yīng)器，觀察發(fā)現(xiàn)，在接種6 h后，90%細(xì)胞貼附上微載體，并開(kāi)始伸展;第2天后細(xì)胞生長(zhǎng)速度增快。隨著細(xì)胞增殖速度增加，灌注量也隨之適當(dāng)增加，在本實(shí)驗(yàn)灌注培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的形態(tài)一直保持較好。

以1×105/mL細(xì)胞濃度接種反應(yīng)器，培養(yǎng)至第4天細(xì)胞密度達(dá)6×106～7×106/mL，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，維持時(shí)間長(zhǎng)，利于病毒生產(chǎn);而以接種細(xì)胞濃度為1×104/mL接種反應(yīng)器后，培養(yǎng)至第6天密度才能達(dá)到高峰，但仍有部分微載體上未長(zhǎng)滿或僅有幾個(gè)細(xì)胞貼壁，甚至出現(xiàn)空球，由于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不利于病毒生產(chǎn)。細(xì)胞增殖曲線見(jiàn)圖1。

圖1 不同細(xì)胞接種量的細(xì)胞增殖曲線

2．2 病毒感染復(fù)數(shù)對(duì)毒價(jià)的影響 以1×105/mL細(xì)胞密度接種反應(yīng)器，于第4天細(xì)胞密度達(dá)7×106/mL左右時(shí)接種病毒，接種前換用維持液，當(dāng)灌注2個(gè)工作體積后接種病毒。病毒感染復(fù)數(shù)分別為0．01和0．001，取樣測(cè)定毒價(jià)后發(fā)現(xiàn)，毒價(jià)高峰出現(xiàn)在第3～4天，以后逐漸下降。兩種感染復(fù)數(shù)的毒價(jià)差別不顯著，0．01MOI的毒價(jià)整體水平略高于0．001MOI，且毒價(jià)高峰較早于后者，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同感染復(fù)數(shù)的病毒增殖曲線

2．3 灌流體積 培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)程中每天監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖含量及檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)葡萄糖的消耗量和細(xì)胞生長(zhǎng)情況調(diào)節(jié)灌注速度，灌注速率為0～3個(gè)工作體積/d，接種病毒后，調(diào)節(jié)灌注速度和收獲速度，在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中控制葡萄糖含量在5 mmol/L左右。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中灌注速度和葡萄糖含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 灌注速度和葡萄糖含量測(cè)定結(jié)果

2．4 病毒含量測(cè)定 以1×105/mL細(xì)胞密度接種反應(yīng)器，將細(xì)胞培養(yǎng)至7×106/mL左右時(shí)接種病毒，接種前換用維持液，當(dāng)灌注2個(gè)工作體積后以感染復(fù)數(shù)為0．01接種病毒，于感染每12 h為時(shí)間段取樣測(cè)定收獲病毒的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同時(shí)間段收獲的病毒含量測(cè)定

從測(cè)定的結(jié)果可以看出在感染后36 h內(nèi)收獲的病毒含量低于106．0TCID50/mL，感染后96 h細(xì)胞完全病變，停止收獲病毒液。將收獲的病毒含量≥106．0TCID50/mL的病毒液用于配苗。

2．5 疫苗制備及質(zhì)量 以1×105/mL細(xì)胞密度接種反應(yīng)器，將細(xì)胞培養(yǎng)至7×106/mL左右時(shí)接種病毒，感染復(fù)數(shù)為0．01，于感染后36 h開(kāi)始收獲，至96 h后停止灌流。將收獲的病毒含量大于106．0TCID50/mL病毒液進(jìn)行凍融后加入凍干保護(hù)劑經(jīng)冷凍干燥制成疫苗。將制備的3批疫苗進(jìn)行無(wú)菌、支原體、外源病毒、病毒含量、安全、效力、剩余水分和真空度等檢驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。疫苗的免疫效力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，3批疫苗的免疫保護(hù)率均為5/5，而對(duì)照組5/5發(fā)病，表明按本工藝制備的疫苗其免疫原性沒(méi)有發(fā)生變化，疫苗質(zhì)量穩(wěn)定。

表3 3批豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果

表4 3批豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的免疫效力攻毒試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

疫苗開(kāi)發(fā)是一個(gè)不斷創(chuàng)新的過(guò)程，目前國(guó)內(nèi)獸用疫苗的生產(chǎn)多采用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝，由于受到轉(zhuǎn)瓶表面積和培養(yǎng)條件的限制，細(xì)胞密度低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，操作過(guò)程易污染，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝在新的疫苗生產(chǎn)中越來(lái)越受限。微載體培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)徹底克服了傳統(tǒng)工藝表面積不足的限制，能在有限的空間內(nèi)提供巨大的表面積，實(shí)現(xiàn)了培養(yǎng)操作的自動(dòng)化控制，降低了污染的機(jī)會(huì)和減少了人力的投入，并且細(xì)胞在良好的生理狀態(tài)下生長(zhǎng)，可以獲得高密度貼壁細(xì)胞，因此具有現(xiàn)代化大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的顯著優(yōu)勢(shì)。

本文研究的PRRS活疫苗生產(chǎn)工藝采用的灌注培養(yǎng)法，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷補(bǔ)充，代謝產(chǎn)物不斷去除，使細(xì)胞處于一種穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，大大提高了細(xì)胞密度。通過(guò)調(diào)節(jié)灌注流量，不僅在細(xì)胞增殖時(shí)穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境，而且在接種病毒后細(xì)胞仍能得到足夠的營(yíng)養(yǎng)和平衡的環(huán)境。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)顯示，在14 L生物反應(yīng)器中細(xì)胞接種量在105/mL左右時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)4 d后密度可達(dá)7×106/mL左右，以0．01MOI感染病毒，接毒 36 h后收獲病毒液，其毒價(jià)在 106．0TCID50/mL以上。細(xì)胞增殖培養(yǎng)過(guò)程中，隨著細(xì)胞數(shù)量的增大，灌注速度加快;接種病毒后，由于細(xì)胞被感染和部分老化脫落，代謝速度減緩，需逐步降低灌注速度，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中每天調(diào)節(jié)灌注速度使培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度維持在5 mmol/L左右。將收獲的病毒液加入適量的凍干保護(hù)劑經(jīng)冷凍干燥制成活疫苗，試制的3批疫苗的病毒含量分別為106．8TCID50/mL、107．0TCID50/mL 和 107．0TCID50/mL，無(wú)菌、支原體等項(xiàng)目的檢驗(yàn)均合格，3批疫苗的免疫保護(hù)率均為5/5。研究表明，生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)Marc－145細(xì)胞法可用于PRRS活疫苗的生產(chǎn)，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，有較好的應(yīng)用前景。

［1］ Meulenberg J．PRRSV，the virus［J］．Vet Res，2000，31(1):11 －21．

［2］ Keffaber K K．Reproductive failureofunknown etiology［J］．American Association of Swine Practitioners(News)，1989，1:1 －10．

［3］ Terpstra C，Wensvoort G，Pol JM A．Experimental reproduction of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome(mystery swine disease)by infection with Lelystad virus:Koch’s postulates fulfilled［J］．Veterinary Quarterly，1991，13(3):131 －136．

［4］ Wensvoort G，Terpstra C，Pol JM，et al．Mystery swine disease in The Netherlands:the isolation of Lelystad virus［J］．Veterinary Quarterly，1991，13(3):121 －130．

［5］ 郭寶清，陳章水，劉文興，等．從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的研究［J］．中國(guó)畜禽傳染病，1996，87(2):1 －5．

［6］ Zhou Y J，Yu H，Tian Z J，et al．Genetic diversity of the ORF5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in China from 2006 to2008［J］．Virus Research，2009，144:136－144．

［7］ 張 韌，秦玉明，陳文慶，等．懸浮培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用和展望［J］．中國(guó)獸藥雜志，2011，45(3):56 －60．

［8］ 李 榮，周勁松，劉國(guó)英，等．口蹄疫疫苗的懸浮培養(yǎng)工藝研究［J］．中國(guó)獸藥雜志，2011，5(7):14 －16．