人結腸癌耐藥細胞系SW480／L－OHP的建立及其耐藥機制初探

張南文，許建華

結直腸癌屬于我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈現(xiàn)較明顯上升態(tài)勢，在大中城市中更加明顯［1］。近年來，各種新技術的應用和發(fā)展使得結直腸癌的治療效果得到不斷提高［2］，但第三代鉑類配合物奧沙利鉑（oxaliplatin，L－OHP）仍是臨床上結直腸癌患者化療最常用的抗癌藥物之一。L－OHP在廣泛應用的同時也導致了耐藥性出現(xiàn)的嚴重問題［3］。本實驗以L－OHP為誘導劑，以遞增SW480細胞培養(yǎng)液中藥物濃度的方式，建立人結腸癌SW480／L－OHP細胞模型，通過和SW480細胞對比，對其生物學特征及產生耐藥的機制進行初步探討。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 SW480人結腸癌細胞系 由福建醫(yī)科大學新藥研究所惠贈。

1．1．2 試劑與藥品 四甲基偶氮唑藍（MTT，美國Amresco公司），二甲基亞砜（DMSO，國藥集團化學試劑有限公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），艾恒（L－OHP，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），羅丹明123（Rhodamine123，Rh123，美國Sigma公司），阿霉素（ADM，浙江海正藥業(yè)股份有限公司），順鉑（DDP，齊魯制藥有限公司），5－氟尿嘧啶（5－FU，上海旭東海普藥業(yè)有限公司）。

1．1．3 主要儀器 培養(yǎng)箱（HEPA CLASS 100，美國Thermo Forma公司），倒置顯微鏡（XDS－1B，日本Olympus公司），酶標儀（Microplate Reader 450，美國Bio－Rad公司），臺式高速離心機（TGL－18C－C，上海安亭科學儀器廠），流式細胞儀（FACS Calibur，美國BD公司）。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養(yǎng) 將人結直腸癌SW480細胞接種在含有10%新生小牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，放入37℃、體積分數為0．05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。用含0．02%EDTA的胰酶（0．125%）消化，收集離心去上清，重懸后傳代，以臺盼藍法在細胞計數板上統(tǒng)計活細胞數量。

1．2．2 耐藥細胞系SW480／L－OHP細胞的構建采用逐步遞增培養(yǎng)液中L－OHP濃度、間歇誘導的方法，從1μg／mL（1／10IC50）開始，48h后棄去含藥培養(yǎng)液，更換新鮮無藥培養(yǎng)液，等到恢復正常生長后，再次加入相同濃度藥物進行誘導，如此反復，逐 步 提 高 （1μg／mL→2μg／mL→3μg／mL→4μg／mL→5μg／mL→6 μg／mL→7μg／mL→8μg／mL），間歇誘導。

1．2．3 測定SW480與SW480／L－OHP細胞生長曲線和群體倍增時間 將對數生長期細胞消化離心后，均調整細胞數為2．5×104mL－1，分別接種于96孔板，每隔24h分別取3個復孔計算1次活細胞數量，共計算7d，以每天的活細胞數量計算群體倍增時間，公式如下：

TD＝t×log2／（logNt－logNo）

TD：群體倍增時間，t：培養(yǎng)時間，N0、Nt分別代表接種后及培養(yǎng)t小時后的細胞數。

將兩種細胞接種于96孔板（共8塊），每孔200μL（每孔5×103），各細胞設6個復孔，每天取1塊板，每孔加 MTT（5mg／mL）20μL，培養(yǎng)4h，離心并小心棄去上清，各孔加150μL DMSO，充分振蕩后，自動酶標儀上測各孔吸光度值（OD570）。以t為橫坐標，以OD570值為縱坐標，繪出生長曲線。

1．2．4 MTT法測定SW480和SW480／L－OHP細胞藥物敏感性 將對數生長期的細胞消化離心后，調整細胞懸液為4×104mL－1。按每孔190μL細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，加入等比稀釋成5種濃度的4種抗腫瘤藥各10μL，以及陽性對照組及陰性對照組，各濃度設5個復孔，再培養(yǎng)48h后，MTT法測出各孔OD570。實驗重復3次。計算各濃度藥物的抑制率：

并算出4種抗腫瘤藥物對2種細胞的半數抑制濃度（IC50）和耐藥指數（RI）：［4］

1．2．5 流 式 細 胞 儀 （FCM）檢 測 SW480 與SW480／L－OHP細胞周期分布 收集細胞后PBS洗2遍，離心并小心去掉上清液，慢慢添加－20℃預冷的體積分數為0．70的乙醇，固定1h。PBS洗2遍后，將等體積的細胞懸液與PI染液混合，避光4℃孵化10min，稍混勻，經200目尼龍膜過濾到流式管中，再加入1mL的PBS，使用FCM進行細胞周期分析。

1．2．6 細胞內Rh123累計的測定 用含0．02%EDTA的胰酶（0．125%）消化處于對數生長期的SW480細胞和SW480／L－OHP細胞，用無血清培養(yǎng)液將細胞調整為密度1×106mL－1的單細胞懸液，分裝在EP管中，實驗組分別加入Rh123（終濃度為2μg／mL），置于飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育50min，離心，PBS緩沖液洗2遍，再重懸于冷PBS緩沖液中。FCM檢測細胞內平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI），Ex 488nm，Em 530nm，觀察對細胞內Rh123的含量。

1．3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用±s表示，樣本均數比較采用成組t檢驗，P＜0．05為差別具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 SW480／L－OHP耐藥細胞的建立及耐藥穩(wěn)定性 歷時約8月的反復誘導，終獲得1株能在含8μg／mL L－OHP培養(yǎng)液中良好生長的耐藥細胞系SW480／L－OHP。MTT 法 測 出 SW480 細 胞 對L－OHP的 IC50為 （11．34±3．52）μg／mL，而SW480／L－OHP細胞的IC50為（70．43±7．98）μg／mL，RI為（6．23±2．33）（P＜0．01）。在無藥培養(yǎng)液中培養(yǎng)1月后，繼用MTT法測定SW480／L－OHP細胞對L－OHP的IC50為（59．6±7．11）μg／mL，RI為（5．27±1．89），耐藥性仍保持原有的84．7%，與撤藥前比較無明顯差別（P＞0．05）。凍存3月的SW480／L－OHP細胞復蘇后生長狀態(tài)良好，其對L－OHP的IC50值為 （58．1±4．69）μg／mL，RI為（5．14±2．16），與正常培養(yǎng)的細胞比較，差別無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），耐藥性保持穩(wěn)定。

2．2 細胞生長曲線和細胞群體倍增時間 細胞生長曲線顯示（圖1），耐藥細胞株SW480／L－OHP較SW480細胞群體倍增時間稍延長，分別為（59．51±2．52）h和（33．06±1．88）h，生長增殖速度減慢，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

圖1 SW480細胞與SW480／L－OHP細胞的生長曲線Fig 1 The growth curve of SW480cells and SW480／L－OHP cells

2．3 SW480和SW480／L－OHP細胞對4種抗腫瘤藥物的敏感性 SW480和SW480／L－OHP細胞對其他3種抗腫瘤藥物5－FU、ADM及DDP的IC50見表1，SW480／L－OHP細胞對3種藥物RI值分別為（2．02±1．02），（1．93±0．88）和 （1．44±0．64）（P＜0．05）。

2．4 細胞周期分布 經FCM進行細胞周期分布顯示，SW480／L－OHP細胞呈現(xiàn) G2／M 期阻滯現(xiàn)象（圖2）。與SW480細胞的G2期為（11．67±1．19）%比較，SW480／L－OHP 細 胞 的 G2期細 胞 上 升 至（15．33±1．86）%，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

2．5 細胞P－gp功能 SW480細胞內Rh123濃度（MFI）為（48．70±1．90）%，SW480／L－OHP細胞內Rh123濃度（MFI）減少至（16．43±1．79）%，差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01，圖3）。

表1 SW480與SW480／L－OHP細胞的藥物IC50比較Tab 1 The IC50of different drugs on SW480cells and SW480／L－OHP cells

圖2 流式細胞儀觀察SW480與SW480／L－OHP細胞周期分布Fig 2 The cell cycle phase distribution of SW480cells and SW480／L－OHP cells by FCM

圖3 流式細胞儀測定細胞內Rhodamine123蓄積量Fig 3 The intracellular accumulation of Rhodamine123assessed by FCM

3 討 論

結直腸癌化療失敗的主要因素是細胞對抗癌藥物產生耐藥，這也是引起腫瘤復發(fā)的主要因素之一。體外誘導構建耐藥細胞株仍是研究耐藥細胞生物學變化及腫瘤耐藥機制的基礎［5］。國內外專家學者已建立了多種腫瘤多藥耐藥（MDR）細胞系，構建一株理想的MDR細胞系是研究其發(fā)生機制不可或缺的重要手段，也是探索MDR逆轉劑的必要條件［6］。

本研究以第三代鉑類——L－OHP為誘導劑，先從1／10IC50的濃度（1μg／mL）開始，逐漸增加培養(yǎng)液中L－OHP濃度以間歇誘導，成功構建人結腸癌奧沙 利 鉑 耐 藥 細 胞 模型 SW480／L－OHP，RI為（6．23±2．33），且對5－FU、ADM、DDP等其他化學結構和（或）作用機制不一樣的抗腫瘤藥也產生了一定的耐藥性。參考Snow和Judd文章［7］，RI＜5認為是低度耐藥，RI為5～15是中度耐藥，而RI＞15歸為高度耐藥。依照此標準界定，則SW480／L－OHP細 胞 對 L－OHP 是 中 度 耐 藥，對5－FU、ADM、DDP等藥物也具有低度耐藥，說明耐藥細胞系SW480／L－OHP細胞具有多藥耐藥特征。

通過繪制細胞的生長曲線，并且計算待測細胞的群體倍增時間，均可發(fā)現(xiàn)：相對于SW480細胞，SW480／L－OHP細胞的增殖生長速度有所減慢；同時，群體倍增時間明顯延長。腫瘤細胞的群體倍增時間越短，表明化療藥物對其較敏感，療效較好；反之，如果細胞群體倍增時間延長，則說明化療藥物對其敏感性下降［8］。FCM 檢測 SW480／L－OHP細胞的結果顯示，其細胞周期出現(xiàn)G2／M期阻滯現(xiàn)象，G2期細胞增多，證明其與SW480細胞相比，出現(xiàn)生長速度減慢的特征。

P－gp是目前研究較深入的ABC蛋白家族成員之一，產生多藥耐藥的機制之一可能是其高表達造成的，P－gp與抗癌藥物及親脂疏水性化合物相結合后，以水解ATP來供能，能逆濃度梯度將已經進入細胞內的藥物泵到細胞外去，導致胞內藥物含量減少而產生耐藥［9］。由于羅丹明是P－gp的良好底物，且具有較好的特異性，本實驗使用羅丹明蓄積實驗法，檢測耐藥與親本細胞P－gp功能改變情況，樣本經由FCM檢測分析顯示，SW480／L－OHP細胞內羅丹明的蓄積量較SW480細胞明顯減少，表明細胞主動外排系統(tǒng)增強，可能是產生其耐藥性的生化機制之一。

綜上所述，本實驗構建的人結腸癌耐藥細胞系SW480／L－OHP，耐藥性較穩(wěn)定且具備多藥耐藥性。在今后的研究中，課題組將繼續(xù)誘導并深入研究和探討腫瘤細胞對L－OHP耐藥的機制，并以此模型探索和篩選理想的逆轉耐藥的新藥。

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