不同產(chǎn)地腎茶HPLC指紋圖譜研究△

李光，陳曦，李宜航，李學(xué)蘭

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100；2.西雙版納州傣藥南藥重點實驗室，云南 景洪 666100；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

不同產(chǎn)地腎茶HPLC指紋圖譜研究△

李光1,2*，陳曦1,3，李宜航1,2，李學(xué)蘭1,2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100；2.西雙版納州傣藥南藥重點實驗室，云南 景洪 666100；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：建立腎茶藥材的HPLC指紋圖譜分析方法。方法：采用Waters ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(含0.1%的磷酸)，梯度洗脫，檢測波長為205 nm，流速為1 mL·min-1。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)版》，計算不同產(chǎn)地腎茶樣品的HPLC指紋圖譜的整體相似度。結(jié)果：共有15個共有峰，13批被測樣品的色譜指紋圖譜與對照指紋圖譜的整體相似度在0.908～0.985。結(jié)論：該指紋圖譜檢測方法簡便、重現(xiàn)性好，可作為腎茶藥材質(zhì)量控制的重要方法。

腎茶；指紋圖譜；高效液相色譜

腎茶Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu又名貓須草，為唇形科腎茶屬多年生草本植物，是傣醫(yī)藥中常用的解藥(排解人體內(nèi)積蓄毒素的藥物)品種，也是傣醫(yī)用于預(yù)防和治療腎、膀胱、尿道疾病的首選藥材，在西雙版納地區(qū)廣泛種植，《貝葉經(jīng)》(傣醫(yī)經(jīng)典論著)中記載其可單方煎湯或開水浸泡當(dāng)茶飲，具有清熱解毒，利水消腫，利尿化石，養(yǎng)腎保腎，涼血止血等功能。近年來，隨著國內(nèi)外學(xué)者深入研究，發(fā)現(xiàn)腎茶的藥理作用不僅僅應(yīng)用于泌尿系統(tǒng)，同時具有抗炎[1]、降血糖血脂[2]、保肝[3]、提高機體免疫力[4]等一系列藥理活性，功效作用明確。隨著以腎茶為原料的保健產(chǎn)品及藥品的開發(fā)，原藥材質(zhì)量控制變得尤為重要，腎茶主產(chǎn)地遍布廣西、海南、云南、東南亞等地，同屬種類較多，簡單來講分為白花和紫花之分，西雙版納地區(qū)使用品種為白花樣品，也有報道臨床紫花品種質(zhì)量優(yōu)于白花品種，所以質(zhì)量問題亟待解決。

在現(xiàn)階段，指紋圖譜技術(shù)是全面、整體地控制中藥質(zhì)量最有效的方法。至目前，未曾見有關(guān)腎茶指紋圖譜方面的文獻報道，為更有效地控制腎茶的質(zhì)量，實驗參照文獻[5]應(yīng)用RP-HPLC方法，建立了腎茶的HPLC指紋圖譜分析方法，為其藥材鑒別和質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

腎茶樣品的產(chǎn)地具體情況見表1。迷迭香酸對照品(批號：ZL20110523MDXS，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)。乙腈(色譜純，美國Fisher公司)，其余試劑均為分析純。

表1 13批腎茶藥材的樣品信息

1.2 儀器

Waters 600高效液相色譜儀配Waters 2489紫外檢測器，Empower色譜工作站(美國沃特世公司)；菲羅門ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，超聲提取器(上海儀器制造廠，SK3200H)，電子天平(德國賽多利斯，CP-224S)，超聲清洗儀(寧波市海曙五方超聲設(shè)備有限公司，WF-500E)，遺傳性超純水儀(英國ELGA公司，ULTRAGE MK2)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制

精密稱取迷迭香酸對照品3.55 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得迷迭香酸濃度均為0.355 mg·mL-1的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制

分別取腎茶粉末(過60目篩)約500 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入50%甲醇10 mL，在常溫下超聲(250 W，40 kHz)提取30 min，過濾，濾液蒸干，加甲醇溶解定容至10 mL，即得供試品溶液。進樣前取適量溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.3 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：菲羅門ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水(含0.1%磷酸)為流動相，梯度洗脫(見表2)，流速：1 mL·min-1，柱溫：40 ℃，檢測波長：205 nm。在上述色譜條件下，按迷迭香酸峰計算理論板數(shù)不低于4 000，與其他色譜峰的分離度大于1.0。

表2 梯度洗脫程序

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取迷迭香酸對照品8.875 mg，置25 mL容量瓶中，水溶解定容，在2.3項色譜條件下分別進樣1，2，4，6，8，10 μL，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到迷迭香酸對照品的回歸方程為Y=106X+52 387，r=0.999 8，顯示迷迭香酸在0.348 6～3.486 μg呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，分別對共有峰的保留時間和峰面積比值進行考察。結(jié)果表明，各共有峰保留時間的RSD<1.9%，峰面積的RSD<2.3%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批樣品6份，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定各共有峰保留時間的RSD<1.8%，峰面積的RSD<3.0%，表明實驗方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，8，16，24 h進樣，測定各共有峰保留時間的RSD<1.2%，峰面積的RSD<2.8%，說明樣品穩(wěn)定性良好。

2.8 腎茶藥材指紋圖譜建立

取腎茶藥材(1～13號樣品)，按2.2項下方法制備供試品溶液，各取20 μL分別進樣，進行HPLC分析；另取迷迭香酸對照品溶液按相同條件進行分析，根據(jù)相對保留時間對樣品圖譜中色譜峰進行歸屬，并以迷迭香酸色譜峰為參比峰，共得到17個共有峰，結(jié)果如圖1所示，將指紋圖譜信號數(shù)據(jù)導(dǎo)入2004A版相似度評價軟件，生成共有模式即對照指紋圖譜，見圖2。

A.迷迭香酸對照品；B.腎茶圖1 腎茶及對照品HPLC指紋圖譜

2.8.1 指紋圖譜及共有指紋峰的標(biāo)定 按照對照品溶液和供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，并對對照品(見圖1)和13個批次供試品的HPLC圖進行檢測。結(jié)果表明1～17號峰在13批次樣品的色譜圖中均出現(xiàn)，以迷迭香酸為參照，即11號峰，計算共有峰保留時間分別為2.956、12.525、13.577、13.978、14.295、14.696、15.665、17.234、17.802、18.303、18.678、20.290、21.226、22.695、23.363、39.045、40.364、42.334，共有指紋峰峰面積之和占總峰面積比值均大于90%，符合《中藥指紋圖譜研究技術(shù)指南(試行)》的要求。因此標(biāo)定此17個峰為共有指紋峰，并據(jù)此建立了腎茶的HPLC指紋圖譜，見圖2。

2.8.2 相似度比較 采用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，對13批腎茶樣品圖譜進行相似度比較。以生成對照指紋圖譜為模板，13批樣品與對照指紋圖譜之間相似度為0.908～0.985，見表3。

圖2 13批腎茶藥材指紋圖譜

表3 腎茶藥材共有峰的相對保留時間

2.8.3 腎茶品質(zhì)評價 測定13批不同來源腎茶的HPLC指紋圖譜，并與共有模式圖譜進行比較，計算相似度，以相似度作為優(yōu)質(zhì)藥材的定量判定標(biāo)準(zhǔn)，見表4。

結(jié)果表明，由相似度可以看出，以福建鼓浪嶼的紫花腎茶相似度最高，為0.985，紫花與白花腎茶平均相似度分別為0.966 2和0.951 7，說明紫花腎茶較白花腎茶質(zhì)量更加穩(wěn)定；由迷迭香酸含量可以看出，以云南景洪市藥植所的紫花腎茶含量最高，為1.51%，紫花與白花腎茶迷迭香酸含量平均為0.94%和0.92%，說明紫花腎茶有效成分含量要優(yōu)于白花腎茶。綜合上述，云南地區(qū)的紫花腎茶可能為優(yōu)質(zhì)品種，藥理作用是否更好，還待下一步研究。

表4 13批腎茶來源及HPLC指紋圖譜相似度

3 討論

實驗對乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.5%醋酸水溶液和乙腈-1%醋酸水溶液系統(tǒng)進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有在乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)下保留時間較適合且峰形較好，所以將乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)確定為流動相。

實驗對檢測波長進行了考察，記錄并比較了不同波長的指紋圖譜，結(jié)果在205 nm檢測波長下，指紋圖譜中色譜峰較多，信息較豐富，所以選擇205 nm為檢測波長。

通過比較紫花腎茶與白花腎茶的平均相似度，發(fā)現(xiàn)紫花腎茶優(yōu)于白花腎茶，這也為臨床用藥提供了技術(shù)參考。

實驗采用HPLC技術(shù)對腎茶樣品中黃酮類化合物進行了檢測，通過對13批次腎茶樣品色譜峰保留時間和峰面積百分比的比較和分析，對共有指紋峰進行了標(biāo)定，并據(jù)此成功建立了腎茶藥材的HPLC指紋圖譜。經(jīng)過對不同產(chǎn)地腎茶樣品的HPLC圖譜的比較，結(jié)果表明，實驗獲得的色譜指紋圖譜在不同產(chǎn)地腎茶樣品中具有極大的相似性，從而可以有效反映同一物種個體間的相似性，可以作為腎茶專屬性的指紋圖譜，為腎茶的藥材鑒別和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[1] 高南南，田澤，李玲玲，等.腎茶藥理作用的研究[J].中草藥，1996，27(10)：615.

[2] Mohamed E A H，Mohamed A J，Asmawi M.Antihyperglycemic Effect of Orthosiphon Stamineus Benth Leaves Extract and Its Bioassay-Guided Fractions[J].Molecules，2011，16(5)：3787-3801.

[3] Mohammed A.Hepatoprotective Effects of Orthosiphon stamineus Extract on Thioacetamide-Induced Liver Cirrhosis in Rats[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2011，(1)：1-6.

[4] 岑小波，王瑞淑.腎茶對小鼠免疫功能的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，1997，(1)：78-79.

[5] 陳志紅，徐美奕，龔先玲.紫荊花黃酮類化合物的HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2010，(31)：2927-2928.

HPLCFingerprintofDifferentOriginOrthosiphonstamineus

LI Guang1,2*，CHEN Xi1，3，LI Yi-hang1,2，LI Xue-lan1,2

(1.YunnanBranch，InstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Jinghong666100，China；2.KeyLaboratoryofDaiandSouthernMedicineofXishuangbannaDaiAutonomousPrefecture,Jinghong666100 ,China; 3.InstituteofMedicinalPlant,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193 ,China)

Objective:To establish the analysis method of fingerprint forOrthosiphonstamineusby HPLC.Methods：A column of Waters ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)was used.The mobile phase consisted of acetonitrile-water(containing 2% acetic acid)with gradient elution. The detective wavelength was 205 nm，and the flow rate was 1.0 mL·min-1.The similarity of different originalOrthosiphonstamineussamples were compared by Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of CMM Version 2004A.Results：The fingerprint consisted of 15 common peaks.And the similarity was in the range of 0.908～0.985.Conclusion：This method is simple，accurate，and with good reproducibility，can be used specifically for the quality control ofOrthosiphonstamineus.

Orthosiphonstamineus； Fingerprint； HPLC

2012-11-20)

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中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院青年科研基金項目(XHYN-01),中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(YZYN-11-03)，云南省科技重大項目——傣藥南藥特色資源評價及保育技術(shù)研究(2008IF018)

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李光，Tel：(0691)2136981，E-mail：lhbg311@hotmail.com