結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株Hsp16．3基因缺失突變株的構(gòu)建與鑒定

田璽擇，吳 芳，章 樂(lè)，曹旭東，張萬(wàn)江

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的世界性傳染病，我國(guó)的結(jié)核病疫情依然十分嚴(yán)重，肺結(jié)核病的發(fā)病和死亡人數(shù)始終排在法定報(bào)告?zhèn)魅静〉氖孜?。結(jié)核分枝桿菌感染人體后主要寄生在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)，結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白 （small heat shock proteins，sHSPs）Hsp16．3是其在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)生存繁殖所必需的蛋白質(zhì)［1－2］，雖然有研究表明 Hsp16．3對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染具有非常重要的作用［3－4］，然而目前對(duì) Hsp16．3基因（hspX，Rv2031C）的功能仍知之甚少。本研究利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株Hsp16．3基因缺失突變株，為進(jìn)一步研究Hsp16．3基因的功能及探討結(jié)核病的防治提供可行的研究方法。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種和質(zhì)粒 結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv菌株、大腸桿菌DH5α由本室保存，pKO質(zhì)粒由美國(guó) Washington university的Sherman DR教授惠贈(zèng)，pMD19－T載體購(gòu)于Takara公司。

1．1．2 試劑及材料 限制性內(nèi)切酶 KpnI、BamHI、PstI、HindIII、T4DNA 連接酶（Fermentas公司），Taq酶（Takara公司），質(zhì)粒抽提試劑盒、產(chǎn)物純化試劑盒、切膠回收試劑盒（上海生工生物工程公司）。潮霉素（hygromycin）購(gòu)于Roch公司，卡那霉素（kanamycin）購(gòu)于Solarbio公司，油酸（oleicacid）、白蛋白（albumin）、葡萄糖（dextrose）和過(guò)氧化氫酶（catalase）的復(fù)合組分（英文縮寫為OADC）購(gòu)自Difco公司，電轉(zhuǎn)儀購(gòu)于Eppendorf公司。

1．2 方法

1．2．1 結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv菌株基因組DNA的提取與純化 將結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv接種到Sauton液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)3～4周后收集菌體，基因組DNA的具體提取方法見參考文獻(xiàn)［5］。

1．2．2 引物設(shè)計(jì)及目的基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中Hsp16．3基因的全序列，并結(jié)合結(jié)核分枝桿菌H37Rv國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株全基因組序列自行設(shè)計(jì)引物：

引 物 P1：5′－TTAGGTACCCACCGTGGTCCGAGATT－3′（KpnI），

引物P2：5′－ATAGGATCCCCCGTGTACGTGCTGAAT－3′（BamHI），

引物P3：5′－TTACTGCAGGGATAGCCGAGGACCACA－3′（PstI），

引 物 P4：5′－TTAAAGCGGGCAATACGGCGGAAAGC－3′（HindIII）。

引物 P4：5′－CGCGGATCCATGGCCACCACCCTTC－3′

引 物 P6：5′－CCCAAGCTTTCAGTTGGTGGACCGG－3′

引物由北京六合華大基因公司合成。序列中下劃線部分表示引入的酶切位點(diǎn)，引物P1與P2分別引入KpnI和BamHI的酶切位點(diǎn)，引物P1與P2擴(kuò)增產(chǎn)物為 Hsp16．3基因5′端側(cè)翼序列5′－Hsp 16．3，PCR 產(chǎn) 物 長(zhǎng) 度663bp，PCR 反 應(yīng) 條 件 為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，57．9℃退火1 min，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min；引物P3與P4分別引入PstI和HindIII的酶切位點(diǎn)，引物P3與P4擴(kuò)增產(chǎn)物為Hsp16．3基因3′端側(cè)翼序列3′－Hsp16．3，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度684bp，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min；引物P5與P6擴(kuò)增產(chǎn)物為Hsp16．3基因，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度435bp，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，62℃退火45s，72℃延伸50s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1．2．3 目的基因的克隆及鑒定 按照Molecular cloning：a laboratory manual［6］方法，將 PCR 擴(kuò)增出的5′－Hsp16．3和3′－Hsp16．3用 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化后，分別與pMD19－T載體連接，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100μg／mL氨芐青霉素的LB平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，取單菌落進(jìn)行菌液PCR篩選，抽提質(zhì)粒并進(jìn)行質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆送北京六合華大基因公司測(cè)序。

1．2．4 基因打靶載體的構(gòu)建 將pKO質(zhì)粒DNA和 T－5′－Hsp16．3分別用限制性內(nèi)切酶 KpnI和BamHI于37℃雙酶切3h，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，分別切膠回收純化。純化后的線形質(zhì)粒DNA與5′－Hsp16．3用T4DNA連接酶22℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后篩選并鑒定。將得到的陽(yáng)性重組質(zhì)粒DNA與T－3′－Hsp16．3分別用限制性內(nèi)切酶PstI和HindIII于37℃雙酶切3h，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別切膠回收純化，將純化后得到的線形質(zhì)粒DNA與3′－Hsp16．3用T4DNA連接酶22℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含50μg／mL卡那霉素的LB平板，37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)16h，挑取單菌落做菌液PCR篩選，將陽(yáng)性克隆接種于含50μg／mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜，次日抽提重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒命名為pKO－Hsp16．3，構(gòu)建示意圖見圖1。

1．2．5 基因打靶載體的PCR鑒定、雙酶切鑒定及測(cè)序 以構(gòu)建出的pKO－Hsp16．3重組質(zhì)粒DNA為模板，分別以P1、P2和P3、P4為引物擴(kuò)增兩個(gè)目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。將構(gòu)建出的pKO－Hsp16．3重組質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶KpnI、BamHI和PstI、HindIII于37℃雙酶切3h，雙酶切后，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。并將pKO－Hsp16．3重組質(zhì)粒送北京六合華大基因公司測(cè)序。

圖1 結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株Hsp16．3基因打靶載體的構(gòu)建示意圖Fig．1 Construction of targeting vector for gene encoding Hsp16．3of Mycobacterium tuberculosis H37Rv

1．2．6 結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備及電轉(zhuǎn)化 結(jié)核分枝桿菌H37Rv接種于含有100mL Sauton培養(yǎng)液的錐形瓶中，200r／min搖床37℃培養(yǎng)。將搖床培養(yǎng)約2周的結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株冰浴1h后，4 000r／min離心10min收集菌體。棄上清后，重懸于10%的預(yù)冷甘油中4 000r／min離心10min，重復(fù)洗滌3次，用10%的預(yù)冷甘油重懸菌體后用于電轉(zhuǎn)化。取100μL菌液加入純化后的pKO－Hsp16．3重組質(zhì)粒4μg后轉(zhuǎn)入0．1cm的電極杯中，在18×105V／m，25μF，1 000Ω條件下電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)后用1mL含10%OADC的Sauton培養(yǎng)液稀釋并轉(zhuǎn)移到10mL試管中，37℃復(fù)蘇20h，取300μL涂布于含10%OADC及30 μg／mL卡那霉素的Sauton固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)3～4周至單個(gè)菌落形成。

1．2．7 Hsp16．3基因缺失突變株的篩選及鑒定從Sauton固體培養(yǎng)基平板上挑取菌落接種至5mL含10%OADC及30μg／mL卡那霉素的Sauton培養(yǎng)液中，37℃靜置培養(yǎng)2～3周，待菌膜生長(zhǎng)超過(guò)50%后，挑菌并加入l×三羥甲基氨甲烷－乙二胺四乙酸（Tris－EDTA．TE）15μL重懸菌體，煮沸10 min，4 000r／min離心2min，取上清2μL為模板，以引物P1和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同前。擴(kuò)增后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，標(biāo)記只擴(kuò)增出2 600bp左右的DNA片段的菌株。取作標(biāo)記的菌株的菌液，分別接種于含有10%OADC和10%蔗糖 （sucrose）的Sauton液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2～3周，可挑菌并加入TE 15μL重懸菌體，煮沸10min，4 000r／min離心2min，取上清2μL為模板，以引物P1和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同上，擴(kuò)增后進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳分析。將僅擴(kuò)增出2 600bp左右的DNA片段的菌株作標(biāo)記，取作標(biāo)記的菌株的菌液，以P5和P6為引物，以未作電穿孔的H37Rv菌株為對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同前。同時(shí)取作標(biāo)記的菌株的菌液，接種到5 mL含10%OADC和50μg／mL潮霉素的Sauton培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)2～3周，觀察其生長(zhǎng)。

2 結(jié) 果

2．1 目的基因PCR擴(kuò)增的檢測(cè) 以結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv菌株全基因組DNA序列為模板，分別以引物P1、P2和引物P3、P4擴(kuò)增兩個(gè)目的片段5′－Hsp16．3和3′－Hsp16．3，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示663bp和684bp的兩條特異性擴(kuò)增條帶，符合預(yù)期大小。

2．2 pKO－Hsp16．3基因打靶載體的PCR、雙酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果 以pKO－Hsp16．3質(zhì)粒DNA為模板，分別以引物P1、P2和P3、P4擴(kuò)增兩個(gè)目的片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示663bp和684bp的兩條特異性擴(kuò)增條帶，同預(yù)期結(jié)果相一致（圖2），重組質(zhì)粒pKO－Hsp16．3分別經(jīng)KpnI、BamHI和PstI、HindIII雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得663bp和684bp的兩條特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖3）。并將該重組質(zhì)粒pKO－Hsp16．3送北京六合華大基因公司測(cè)序，證實(shí)兩個(gè)目的片段5′－Hsp16．3和3′－Hsp16．3已插入到預(yù)定位點(diǎn)，說(shuō)明已成功構(gòu)建出結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株Hsp16．3基因打靶載體。

圖2 pKO－Hsp16．3重組質(zhì)粒的質(zhì)粒PCR鑒定Fig．2 PCR identification of pKO－Hsp16．3vectorM：Marker DL2000；1：PCR product of primer 1 and primer 2；2：PCR product of primer 3and primer 4．

圖3 pKO－Hsp16．3重組質(zhì)粒的雙酶切電泳分析Fig．3 Restriction analysis of pKO－Hsp16．3vector 1：pKO－Hsp16．3／（Kpn Ⅰ＋BamH Ⅲ）；2：pKOHsp16．3／（Pst Ⅰ ＋ Hind Ⅲ ）； M1： Marker DL15000

圖4 結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株Hsp16．3基因缺失突變株的菌落PCR鑒定Fig．4 PCR identification of H37Rv strain with Hsp16．3gene deleted mutantM：Marker DS15000；1：Negative control；2－3：Different H37Rv strains with Hsp16．3gene deleted mutant identified by PCR．

2．3 pKO－Hsp16．3基因缺失突變株的篩選與鑒定基于pKO質(zhì)粒自身的特點(diǎn)，在篩選時(shí)采用PCR的方法，在卡那霉素篩選后，進(jìn)行蔗糖的反篩選，由于帶有蔗糖基因的菌株不能夠在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因此將含有10%蔗糖的Sauton培養(yǎng)基上的菌落做PCR鑒定，僅擴(kuò)增出了長(zhǎng)度為2 600bp左右DNA片段（圖4）。將這些菌落以P5和P6為引物做PCR鑒定（圖5），均未能擴(kuò)增出435bp左右的片段，并且在含潮霉素的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)的菌株即為Hsp16．3基因缺失突變株。

圖5 結(jié)核分枝桿菌Hsp16．3基因缺失突變株的電泳分析Fig．5 Electrophoresis of MTB strains with Hsp16．3gene deleted mutantM：Marker DL2000；1：H37Rv strain identified by PCR；2－3：H37Rv strains with Hsp16．3gene deleted mutant identified by PCR．

3 討 論

全球約有1／3人口被結(jié)核分枝桿菌潛伏感染［7］，該人群在免疫力下降，尤其是免疫系統(tǒng)受到損害時(shí)會(huì)發(fā)展成為結(jié)核病。結(jié)核分枝桿菌在低氧或缺氧狀態(tài)時(shí)會(huì)大量合成 Hsp16．3［8－11］，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染小鼠巨噬細(xì)胞后期，Hsp16．3的表達(dá)量則會(huì)更多，T細(xì)胞可以特異性的識(shí)別Hsp16．3蛋白，并將其從被感染的巨噬細(xì)胞中分離出來(lái)，這種反應(yīng)在結(jié)核分枝桿菌潛伏期更為明顯［12－14］，說(shuō)明 Hsp16．3蛋白在結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染階段扮演著重要角色。宿主對(duì)結(jié)核分枝桿菌等細(xì)胞內(nèi)寄生菌的防御主要依賴于有效的細(xì)胞免疫，其機(jī)制為被感染的巨噬細(xì)胞被細(xì)胞免疫因子所活化，尤其是由自然殺傷細(xì)胞和抗原特異性T細(xì)胞產(chǎn)生的γ干擾素。Hsp16．3抗原能夠部分活化結(jié)核菌素純蛋白衍生物 （PPD）試驗(yàn)陽(yáng)性機(jī)體的外周血單核細(xì)胞和CD＋4T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞免疫反應(yīng)，并分泌干擾素，有效清除結(jié)核分枝桿菌［1］；同時(shí)CD＋8T淋巴細(xì)胞可以識(shí)別Hsp16．3的多肽表位，活化的CD＋8T淋巴細(xì)胞可以誘導(dǎo)產(chǎn)生γ干擾素和α干擾素，從而通過(guò)粒細(xì)胞溶解素和表位穿孔素溶解被結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞，因此，對(duì)Hsp16．3蛋白的研究可以為結(jié)核新型疫苗的研究提供有力依據(jù)［15］，尤其是對(duì)潛伏感染者可能起到有效預(yù)防作用［16］。另有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入宿主巨噬細(xì)胞后，既可以誘導(dǎo)合成大量的 Hsp16．3蛋白［16］，又可通過(guò)調(diào)控宿主巨噬細(xì)胞的凋亡來(lái)逃避宿主巨噬細(xì)胞的殺傷，進(jìn)而在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖和致病。然而Hsp 16．3蛋白在結(jié)核分枝桿菌與宿主巨噬細(xì)胞相互作用中的作用機(jī)理尚不清楚。因此為了深入探討結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于Hsp16．3基因功能的研究已十分必要。

基因打靶技術(shù)是一種理想的修飾改造生物遺傳物質(zhì)的新興技術(shù)，是研究目的基因功能的有效方法?；虼虬屑夹g(shù)的關(guān)鍵是打靶載體的構(gòu)建，pKO質(zhì)?？梢栽诖竽c桿菌中進(jìn)行復(fù)制，而在結(jié)核分枝桿菌中不能自主擴(kuò)增，并且pKO質(zhì)粒具有正選擇標(biāo)記基因Kan（卡那基因）和負(fù)選擇標(biāo)記基因sacB（蔗糖基因），在進(jìn)行基因缺失突變株的篩選時(shí)，由于含有sacB蔗糖負(fù)選擇標(biāo)記基因，在含有蔗糖的培養(yǎng)基中帶有sacB基因的菌體將不能存活，故無(wú)需再用Southern blotting技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，因此pKO質(zhì)粒被認(rèn)為是結(jié)核分枝桿菌中進(jìn)行基因敲除的良好載體［17］。本研究通過(guò)擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株Hsp16．3基因兩側(cè)Rv2030c基因和acg基因中分別為663bp和684bp的兩個(gè)DNA片段，并插入到pKO質(zhì)粒的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)，得到了結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株Hsp16．3基因打靶載體，并將該打靶載體電轉(zhuǎn)入結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株中進(jìn)行同源重組，成功構(gòu)建出了結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv菌株Hsp16．3基因缺失突變株。為進(jìn)一步研究Hsp16．3基因的功能及探討結(jié)核病的防治與新型結(jié)核疫苗的研究提供可行的研究方法。

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