一起皮膚炭疽疫情病原的實驗室檢測及毒力基因鑒定

談忠鳴，張忠獻(xiàn)，顧 玲，胡建利，朱葉飛，祁 賢，董 晨，湯奮揚(yáng)，周明浩，鮑倡俊

炭疽（Anthrax），是由炭疽桿菌（Bacillus anthracis）引起的人獸共患傳染病。人感染炭疽，根據(jù)感染途徑的不同，又分為皮膚炭疽、胃腸炭疽和肺炭疽。皮膚炭疽最為常見，主要為人接觸感染炭疽桿菌牲畜的毛皮和肉類所致，病死率不高，可以徹底治愈，甚至自愈。人也可經(jīng)呼吸道傳播導(dǎo)致肺炭疽，或由食用感染炭疽的牲畜肉類而引起胃腸炭疽，嚴(yán)重感染者可引發(fā)炭疽性腦膜炎，甚至死亡。炭疽桿菌在極端環(huán)境中形成芽孢，可長期存在于自然界中，無法消除。由于炭疽芽孢桿菌的穩(wěn)定性［1］和致病性，使其成為較常見的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖襲擊武器［2］。

2012年8月，連云港市疾病預(yù)防控制中心接到連云港市第四人民醫(yī)院關(guān)于發(fā)現(xiàn)疑似皮膚炭疽病例的報告，遂組織人員與當(dāng)?shù)乜h疾病預(yù)防控制中心共同趕赴病例所在地進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)4例疑似皮膚炭疽病例，并采集疑似病例標(biāo)本和病牛肉標(biāo)本送至我實驗室進(jìn)行檢測?，F(xiàn)將本實驗室的檢測結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本采集和處理 采集4例疑似皮膚炭疽病例的血清、血球、焦痂及宰殺的病死牛肉標(biāo)本。血塊和牛肉各取200μg，放入2mL無菌E－P管中；病人焦痂標(biāo)本直接放入2mL無菌E－P管中。各管加入200μL無菌生理鹽水，研磨混勻成組織懸液。采用QIAGEN 公 司 試 劑 盒 （QIAamp DNA mini kit，Qiagen）提取DNA，操作步驟參照試劑盒使用說明書，核酸－80℃保存待用。

1．2 Real－time PCR 檢測 采用 Real－time PCR 方法檢測炭疽桿菌染色體上RNA聚合酶β亞單位編碼基因（rpoB）［3］、質(zhì)粒 PXO1上保護(hù)性抗原基因pag［3］、質(zhì)粒PXO2上莢膜基因（poly－γ－D－glutamic capsule）的片段capA［4］，引物序列見表1。反應(yīng)體系為：10μL Master Mix（ABI Universal TaqMan Master Mix，Applied Biosystems），300nmol／L 上下游引物，250nmol／L探針，2μLDNA 模板，H2O補(bǔ)至20μL。循環(huán)程序為：50 ℃ 2min，95 ℃10min，40個循環(huán)為95℃15s，60℃1min并收集信號。熒光定量PCR儀為ABI的7500Real Time PCR System。

表1 炭疽桿菌rpoB基因、pag基因和capA基因?qū)崟r熒光PCR引物及探針序列Tab．1 Primers and probes of real－time PCR for detection on specific genes（rpoB，pag，and capA）of Bacillus anthracis

1．3 毒力基因檢測 建立普通PCR方法檢測炭疽桿菌質(zhì)粒上的毒力基因。靶基因為位于質(zhì)粒PXO1上編碼炭疽桿菌毒素的水腫因子 （edema factor）cya基因，致死因子（lethal factor）lef 基因，保護(hù)性抗原（protective antigen）pag基因，以及位于質(zhì)粒PXO2上的莢膜基因（poly－γ－D－glutamic capsule）cap基因［5］。引物序列見表2。反應(yīng)體系為：10×TaKaRa LA buffer 2．5μL，dNTPs 2μL，10pmol／μL上下游引物各1μL，5UTaKaRa LA Taq酶0．15μL，DNA模板5μL，H2O補(bǔ)足25μL。循環(huán)程序為：94℃4min；35個循環(huán)為94℃1min，51℃40s，72℃30s；72℃5min。PCR擴(kuò)增儀為ABI的9800Fast Thermal Cycler。PCR產(chǎn)物1．5%瓊脂糖電泳分析結(jié)果。

1．4 序列分析 炭疽桿菌毒力基因的PCR產(chǎn)物TaKaRa試劑盒回收（TaKaRa Mini Best Agarose Gel DNA Extraction Kit，TaKaRa）并測序，測序儀為 Applied Biosystems／HITACHI 3500xL（Hitachi High－technologies Corporation，Tokyo，Japan）。測序結(jié)果MEGA 4．0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2．1 流行病學(xué)調(diào)查 2012年7月來源于外省的200余頭牛，運達(dá)江蘇省連云港市贛榆縣時發(fā)現(xiàn)其中1頭病牛，當(dāng)?shù)?0名村民對其進(jìn)行了放血、宰殺。之后，有4人陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)熱、局部皮膚腫脹等癥狀。收到報告后，江蘇省疾病預(yù)防控制中心立即介入調(diào)查，確定4例疑似皮膚炭疽病例中2例為臨床診斷病例，另外2例因癥狀不典型被列為醫(yī)學(xué)觀察對象，并通過“中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)”及時進(jìn)行了病例個案報告。經(jīng)當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心的主動搜索，又發(fā)現(xiàn)3名醫(yī)學(xué)觀察對象。7例病例的詳細(xì)情況見表3。

表2 毒力基因引物序列Tab．2 PCR primers for virulence genes of Bacillus anthracis

表3 流行病學(xué)調(diào)查對象基本信息及Real－time PCR檢測結(jié)果Tab．3 Results of epidemiological investigation and real－time PCR

2．2 Real－time PCR 鑒定 對4例疑似皮膚炭疽病人的臨床標(biāo)本和病牛肉標(biāo)本分別進(jìn)行實時熒光PCR檢測。檢測的靶基因為染色體上rpoB基因、質(zhì)粒PXO1上的pag基因和質(zhì)粒PXO2上的capA基因。結(jié)果顯示只有病人的焦痂標(biāo)本和病牛肉標(biāo)本檢測出3種基因的熒光信號，CT值均小于35（圖1）。病人血標(biāo)本中未檢測出熒光信號。

2．3 毒力基因檢測 對4例皮膚炭疽病例的焦痂標(biāo)本和病牛肉標(biāo)本分別進(jìn)行毒力基因檢測。cya、pag和lef基因位于質(zhì)粒PXO1上，分別編碼水腫因子、保護(hù)性抗原和致死因子。與芽孢形成有關(guān)的基因如capA、capB、capC等則位于pXO2質(zhì)粒上，本次實驗以capA為靶基因。結(jié)果顯示在900bp、719bp、373bp和807bp處分別出現(xiàn)目的條帶，陰性對照無擴(kuò)增條帶（圖2）。

2．4 序列分析 為驗證DNA片段的正確性，所有陽性的毒力基因PCR產(chǎn)物回收測序，GenBank中進(jìn)行比對，結(jié)果證實4份病人的標(biāo)本和病牛肉標(biāo)本全部為炭疽桿菌質(zhì)粒上的毒力基因，且序列完全一致。挑選 JS－2012－1、JS－2012－2 和 JS－2012－beef的序列與GenBank中的國際參考株序列進(jìn)行比對。4個毒力基因與炭疽桿菌的國際參考株同源性均在99%以上，僅1～3個堿基的差異。cya基因序列通過比對發(fā)現(xiàn)與美國的3株參考株（str．CDC 684，str．A 0248，str．Ames Ancestor）及意大利2株參考株（str．IT－Carb1－6241，str．IT－Carb3－6254）序列最為接近，僅相差1個堿基。pag基因序列與A16R疫苗株、美國的A0248、Ames Ancestor株及以色列的ISR1980株的序列完全相同。lef基因測序比對結(jié)果顯示江蘇序列與大部分國際參考株序列基本一致。cap基因序列比對結(jié)果顯示3株美國參考株與韓國株（str．H9401）序列完全一致，與江蘇序列存在一個堿基的差異。序列分析結(jié)果說明炭疽桿菌毒力基因相當(dāng)保守，同源性非常高。與蠟樣芽孢桿菌炭疽生物型參考株（str．CI）的序列同源性在99%以上。

圖1 實時熒光PCR檢測炭疽桿菌rpoB基因、pag基因和capA基因Fig．1 Detection on specific genes（rpoB，pag，and capA）of Bacillus anthracis by real－time PCR

圖2 4種毒力基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig．2 Detection on virulence genes of Bacillus anthracis by PCRFigure above M：100bp DNA ladder marker；1：cya－JS－2012－1；2：cya－JS－20120－2；3：cya－JS－2012－3；4：cya－JS－2012－4：5：Negative：6：pag－JS－2012－1；7：pag－JS－20120－2：8：pag－JS－2012－3；9：pag－JS－2012－4；10：Negative；11：lef－JS－2012－1；12：lef－JS－20120－2；13：lef－JS－2012－3；14：lef－JS－2012－4；15：Negative．Figure below M：100bp DNA ladder marker；1：cap－JS－2012－1；2：cap－JS－20120－2；3：cap－JS－2012－3；4：cap－JS－2012－4；5：Negative；6：cya－beef；7：Negative；8：lef－beef；9：Negative；10：cap－beef；11：Negative；12：pag－beef．

3 討 論

炭疽桿菌是一種危害極大的人獸共患病原微生物，形成芽孢以后可長期存在于土壤、草木和動物的骨骼中，所以炭疽桿菌很難根除。當(dāng)牛、羊等家畜啃食草根或翻動泥土?xí)r會感染炭疽桿菌而發(fā)病，人類主要通過接觸感染了炭疽的家畜毛皮或食其肉而得病。我國主要以散發(fā)或小爆發(fā)為主，皮膚炭疽最為常見，病例多集中在西、北及西南幾個省，感染后很少出現(xiàn)人與人相互傳播［6］。

2012年7－8月我省連云港贛榆縣發(fā)生一起炭疽疫情，10名當(dāng)?shù)卮迕駥?頭病牛進(jìn)行放血、宰殺，隨后7名村民出現(xiàn)不同程度的皮膚炭疽癥狀。為了在第一時間診斷病原，本實驗室對4名病例的臨床標(biāo)本（血、焦痂）和病死牛肉標(biāo)本進(jìn)行 Real－time PCR快速檢測。檢測的3種靶基因分別是炭疽桿菌染色體上rpoB基因、質(zhì)粒PXO1上選擇保護(hù)性抗原pag基因和質(zhì)粒PXO2上莢膜基因cap。rpoB基因負(fù)責(zé)合成RNA聚合酶β－亞單位，是一種高度保守的管家基因，可作為鑒定細(xì)菌的標(biāo)簽序列［7］。檢測pag和cap可知曉炭疽桿菌是否攜帶對應(yīng)的質(zhì)粒PXO1和PXO2。如只攜帶其中一個質(zhì)粒，為弱毒株；若兩個質(zhì)粒均攜帶，即為強(qiáng)毒株；如果兩個質(zhì)粒均丟失，則為無毒株。實驗結(jié)果顯示在病人的焦痂標(biāo)本和病牛肉中rpoB基因、pag和cap陽性。表明本次疫情是炭疽桿菌強(qiáng)毒株導(dǎo)致。血標(biāo)本中未檢測出信號，可能與病人已使用抗生素（青霉素、左氧氟沙星）有關(guān)，但不能排除炭疽桿菌不入血的可能。

為進(jìn)一步驗證實時熒光PCR的結(jié)果，我實驗室對陽性標(biāo)本進(jìn)行四種毒力基因的鑒定并測序分析。包括質(zhì)粒PXO1上分別編碼水腫因子（edema fcator）、保護(hù)性抗原PA（protective antigen）和致死因子（lethal factor）的cya基因、pag基因和lef 基因以及質(zhì)粒PXO2上編碼 多聚－γ－D－谷氨酸莢膜的cap基因。測序結(jié)果表明，4例病人標(biāo)本和病牛肉的4種毒力基因序列完全相同，進(jìn)一步驗證了流行病學(xué)調(diào)查和Real－time PCR結(jié)果。通過 GenBank比對國際參考株，江蘇標(biāo)本質(zhì)粒PXO1上毒力基因序列與美國 CDC 684株、Ame Ancestor株、A 0248株及疫苗株A16R最為接近，僅相差1～2個堿基，pag基因序列甚至完全相同，同源性非常高。這可能與炭疽桿菌形成芽孢后可長期保存于自然環(huán)境中，從而減少了進(jìn)化頻率，使得炭疽桿菌菌株間極端同源。GenBank中炭疽桿菌質(zhì)粒PXO2的cap基因上傳序列較少。

綜上所述，本此疫情中使用的炭疽桿菌分子診斷方法可檢測病人臨床標(biāo)本及動物標(biāo)本，此方法快速、便捷、可靠，能區(qū)分強(qiáng)毒株、弱毒株和無毒株，可應(yīng)用在炭疽疫情及生物反恐的快速檢測中。毒力基因的序列分析可對疫情中的炭疽桿菌進(jìn)行簡單的溯源追蹤，江蘇序列與疫苗株A16R同源性很高，說明A16R在我國炭疽菌株中具有代表性。測序的結(jié)果可以用來佐證流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果。

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