普氏立克次體重組表面蛋白制備和免疫印跡抗原特異性分析

賈引軍，熊小路，王錫樂，齊 永，焦 俊，段長松，龔文平，溫博海

普氏立克次體（Rickettsia prowazekii）是流行性斑疹傷寒的病原體，普氏立克次體引起的疾病稱為流行性斑疹傷寒（epidemic typhus）。流行性斑疹傷寒是一種急性傳染病，其臨床主要特征為起病急、持續(xù)高熱和瘀點(diǎn)樣皮疹，常伴有劇烈頭痛、背痛，嚴(yán)重病人多有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀。流行性斑疹傷寒的傳播媒介為體虱，故該病又稱虱傳斑疹傷寒（louse－borne typhus）。在戰(zhàn)爭、災(zāi)荒或其它衛(wèi)生情況差的情況下，虱極易繁衍和在集團(tuán)人群中移動(dòng)，特別容易引起流行性斑疹傷寒的暴發(fā)，故該病在戰(zhàn)爭時(shí)發(fā)生稱為戰(zhàn)爭熱（war fever）。第一次世界大戰(zhàn)，普氏立克次體感染2～3千萬人，引起數(shù)百萬人死亡。近數(shù)十年來，隨著大規(guī)模戰(zhàn)爭的消失、人民生活和衛(wèi)生條件的改善，未出現(xiàn)流行性斑疹傷寒的大規(guī)模流行。但是，局部戰(zhàn)爭和災(zāi)荒仍使得流行性斑疹傷寒在某些國家流行，只要人群中有虱的寄生，流行性斑疹傷寒發(fā)生的可能性就存在［1］。

快速確診可能出現(xiàn)的普氏立克次體感染是有效防控流行性斑疹傷寒的關(guān)鍵。目前，流行性斑疹傷寒的診斷主要依賴普氏立克次體全菌抗原做間接免疫熒光（IFA）血清學(xué)分析。普氏立克次體全菌抗原的制備步驟繁雜，并且需要高水平的生物安全設(shè)備；另外IFA的不同立克次體種屬菌體之間的血清學(xué)交叉反應(yīng)也影響其診斷的可靠性［2－3］。因此，發(fā)現(xiàn)普氏立克次體特異性抗原代替全菌抗原做斑疹傷寒的血清學(xué)診斷很有必要［4］。依據(jù)已發(fā)表的普氏立克次體全基因序列和鑒定的普氏立克次體主要蛋白抗原［5－8］，結(jié)合生物信息學(xué)分析，我們選擇8個(gè)預(yù)測抗原性較強(qiáng)的普氏立克次體蛋白抗原分子作為候選診斷抗原。本研究采用分子克隆方法制備出這8個(gè)抗原的重組蛋白，并用免疫印跡分析這些重組蛋白，篩選與普氏立克次體感染血清特異反應(yīng)的蛋白分子作為流行性斑疹傷寒血清學(xué)診斷的候選抗原。

1 材料與方法

1．1 立克次體菌株與實(shí)驗(yàn)感染小鼠血清 普氏立克次體（E株）、莫氏立克次體（Wilmington株）、立氏立克次體（Sheila Smith株）、黑龍江立克次體（054株）、恙蟲病東方體（Gilliam株）、貝氏柯克斯體（新橋株）等立克次體菌株為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所立克次體學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室保存。用Vero細(xì)胞感染的方法對(duì)黑龍江立克次體和立氏立克次體進(jìn)行傳代和保種［9］，其余的立克次體用7日齡雞胚接種的方法進(jìn)行傳代、保種［10］。用以上立克次體分別腹腔接種6周齡BALB／c小鼠，每只接種107菌；感染4周后活殺小鼠取血，分離血清－20℃凍存?zhèn)溆茫?－10］。將每種立克次體感染小鼠血清5份混合，將混合血清用相應(yīng)的立克次體抗原片按常規(guī)方法做間接免疫熒光［11］，測得普氏立克次體感染小鼠血清效價(jià)為1∶640，莫氏立克次體為1∶640，立氏立克次體為1∶1 280，黑龍江立克次體為1∶1 280，恙蟲病東方體為1∶320，貝氏柯克斯體為2560。做免疫印跡時(shí)，每種血清按其間接免疫熒光抗體效價(jià)的1／10稀釋；5份正常小鼠血清混合后做1∶50稀釋。

1．2 試劑與材料 引物為生工生物工程（上海）有限公司合成；Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶試劑為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒為德國QIAGEN產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物回收試劑盒為Bio Basic Inc產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒為OMEGA產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、DL－2000Marker、低分子量蛋白Marker等為中科瑞泰（北京）生物科技有限公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG為北京思語偉業(yè)公司產(chǎn)品；DAB顯色試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品。

1．3 普氏立克次體主要的蛋白抗原基因 結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)告［12－14］的普氏立克次體主要蛋白抗原，從普氏立克次體E株的全基因組序列（序列號(hào)：NC＿000963）中找出相應(yīng)基因，同時(shí)用DNA Star軟件中的Protean程序預(yù)測蛋白的抗原指數(shù)及指標(biāo)［15］其中包括親水性、電荷分布等因素，從而篩選出抗原性較強(qiáng)的8個(gè)主要抗原基因（sca5、ftsZ、groEL、omp、rp828、tolC、tsf、tuf）。

1．4 目的基因的擴(kuò)增 用Primer5．0軟件設(shè)計(jì)8個(gè)目的基因擴(kuò)增引物，引物設(shè)計(jì)的基本原則為保留預(yù)測到的主要抗原區(qū)；其中sca5由于長度超過2 000bp，將其分成兩段（sca5－1和sca5－2）設(shè)計(jì)對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；引物中加入與質(zhì)粒pET－32a相應(yīng)的酶切和連接位點(diǎn)（表1）。目的基因產(chǎn)物擴(kuò)增采用50μL反應(yīng)體系，普氏立克次體DNA模板2 μL（40ng／μL），上下游引物各1μL（20μmol／L），Taq DNA 聚合酶1．25u，dNTP Mixture 2μL，PCR Buffer 5μL；擴(kuò)增條件為95℃ 預(yù)變性5min，然后以95℃ 變性30s、55℃ 退火30s、72℃延伸1min循環(huán)35次，最后72℃延伸5min。將擴(kuò)增產(chǎn)物做1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳完后將凝膠上的目的DNA帶切下，再用凝膠DNA回收試盒分離純化擴(kuò)增的基因片段。

1．5 重組蛋白制備 將擴(kuò)增好的目的基因和pET－32a質(zhì)粒分別用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。將回收的酶切目的基因與相應(yīng)的質(zhì)粒按常規(guī)條件進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。依據(jù)常規(guī)方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞［16］。在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上接種轉(zhuǎn)化菌，用PCR及酶切鑒定帶有目的基因重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌。按常規(guī)方法用IPTG誘導(dǎo)生長在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化菌表達(dá)重組蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后加入樣本液裂解轉(zhuǎn)化菌，然后對(duì)裂解樣本做聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析，鑒定轉(zhuǎn)化菌表達(dá)的目的蛋白。對(duì)表達(dá)目的蛋白的轉(zhuǎn)化菌在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中IPTG誘導(dǎo)生長，按Qiagen公司的Ni－NTA純化試劑盒說明書表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行分離純化。

表1 普氏立克次體主要抗原基因的PCR擴(kuò)增引物Tab．1 Primer－pairs of genes encoding major antigens of R．prowazekii

1．6 對(duì)重組蛋白抗原進(jìn)行免疫印跡分析 用純化后的重組蛋白10μL（0．8mg／mL）加入等量的2×SDS上樣緩沖液煮沸5min進(jìn)行SDS－PAGE電泳，采用半干電轉(zhuǎn)印法將電泳分離后純化重組蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維（PVDF）膜上。感染血清使用前先和超聲裂解pET－32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在室溫下中和2h，以去除血清中與大腸桿菌非特異性反應(yīng)抗體。將血清用含5%脫脂奶粉的PBS緩沖液稀釋，稀釋比例為IFA檢測效價(jià)的1／10倍。將稀釋后血清與載有重組蛋白的PVDF膜室溫作用1h，用PBST（含有0．05%吐溫的PBS緩沖液）洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2 000）室溫反應(yīng)1h，然后經(jīng)過3次PBST洗滌后以DAB顯色試劑盒顯色。

2 結(jié) 果

2．1 重組目的蛋白的原核細(xì)胞表達(dá) 將9對(duì)PCR擴(kuò)增引物分別作PCR，得到了相應(yīng)的DNA片段與預(yù)期大小相符合。將目的基因片段插入原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建相應(yīng)的重組菌。在IPTG的誘導(dǎo)下9個(gè)重組菌中均表達(dá)目的蛋白（圖1）。采用Ni－NTA對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行親和純化，SDS－PAGE分析確認(rèn)獲得分子量與設(shè)計(jì)大小一致的重組目的蛋白（圖2）。

圖1 SDS－PAGE分析重組菌表達(dá)目的蛋白Fig．1 Analysis of the expressed target proteins by SDS－PAGE

2．2 免疫印跡分析重組蛋白 將6種立克次體感染小鼠血清與9個(gè)重組蛋白抗原做免疫印跡，普氏立克次體感染血清除與TolC反應(yīng)陰性外，與其它8個(gè)蛋白反應(yīng)陽性；莫氏立克次體感染小鼠血清與Sca5－1、Sca5－2、Omp、EF－Tu等4個(gè)蛋白反應(yīng)陽性；貝氏柯克斯體感染血清與Sca5－1、Sca5－2、EF－Tu等3個(gè)蛋白反應(yīng)陽性；恙蟲病東方體感染血清與Sca5－1反應(yīng)陽性；立氏立克次體感染血清反應(yīng)與Sca5－1和EF－Tu反應(yīng)陽性；黑龍江立克次體感染血清不與任何蛋白反應(yīng)（表2、圖3）。

圖2 SDS－PAGE電泳分析純化重組蛋白Fig．2 Analysis of the purified recombinant proteins by SDSPAGE

3 討 論

依據(jù)已發(fā)表的普氏立克次體全基因序列和鑒定的普氏立克次體主要蛋白抗原，結(jié)合生物信息學(xué)分析，選擇 Sca5、FtsZ、Omp、GroEL、Rp828、TolC、EF－Ts、EF－Tu等8個(gè)預(yù)測抗原性較強(qiáng)的普氏立克次體蛋白抗原分子，作為流行性斑疹傷寒候選診斷抗原。根據(jù)普氏立克次體E株的全基因序列分析及其注釋發(fā)現(xiàn)：Sca5和Omp為普氏立克次體的表面蛋白；GroEL為60kD熱休克蛋白，為分子伴侶、對(duì)蛋白的折疊起作用［17］；TolC是膜表面的通道蛋白；EF－Ts和EF－Tu為DNA復(fù)制的延伸因子，在立克次體入侵中為GTP水解提供能量；FtsZ可能與立克次體的分裂調(diào)控有密切關(guān)系；Rp828推測可能是一種與宿主細(xì)胞表面相互作用的蛋白。這些蛋白均可呈現(xiàn)在菌體表面，為普氏立克次體的主要表面抗原。我們采用分子克隆技術(shù)研制出與其相應(yīng)的9個(gè)重組蛋白（其中Sca5分子大，制備2個(gè)重組蛋白Sca5－1和Sca5－2）。用普氏立克次體等6種立克次體感染小鼠血清與這9個(gè)重組蛋白抗原做免疫印跡，分析重組蛋白抗原的血清學(xué)反應(yīng)特異性。

圖3 立克次體感染小鼠血清免疫印跡分析普氏立克次體重組蛋白抗原Fig．3 Analysis of the recombinant protein antigens by immunoblot assay with sera from mice infected with rickettsiaeLane 1：Sca5－1；2：Sca5－2；3：FtsZ；4：GroEL；5：Omp；6：Rp828；7：TolC；8：EF－Ts；9：EF－Tu．A：Sera from mice infected with R．prowazekii；B：Sera from mice infected with R．mooseri；C：Sera from mice infected with R．rickettsii；D：Sera from mice infected with R．heilongjiangensis；E：Sera from mice infected with Orientia tsutsugamushi；F：Sera from mice infected with C．burnetii；G：Sera from normal mice．

表2 免疫印跡分析普氏立克次體重組蛋白抗原Tab．2 Immunoblotting of the recombinant protein antigens of R．prowazekii

結(jié)果顯示FtsZ、GroEL、EF－Ts、Rp828等4個(gè)蛋白特異性最好，僅與普氏立克次體感染小鼠血清反應(yīng)，因此FtsZ、GroEL、EF－Ts、Rp828等4個(gè)蛋白抗原可以認(rèn)作普氏立克次體特異性抗原。其次是Omp，它除與普氏立克次體感染小鼠血清反應(yīng)外，僅與莫氏立克次體感染血清反應(yīng)。莫氏立克次體與普氏立克次體有最密切的親緣關(guān)系，用全菌抗原對(duì)其感染動(dòng)物或患者血清做IFA時(shí)，呈現(xiàn)嚴(yán)重的血清學(xué)交叉。如果采用這些普氏立克次體特異性蛋白抗原做血清學(xué)檢測（如ELISA或蛋白芯片分析）將有可能很好的區(qū)分普氏立克次體與莫氏立克次體感染。本研究僅僅是采用實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物血清對(duì)這些普氏立克次體重組蛋白抗原特異性進(jìn)行了分析，仍需要采用相應(yīng)感染患者血清對(duì)其做進(jìn)一步分析，以明確其在斑疹傷寒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

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