類風(fēng)濕膠囊質(zhì)量控制研究

阮建兵，鄒文哲，金學(xué)平

(武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院 環(huán)境與生化工程系，湖北 武漢 430205)

類風(fēng)濕膠囊質(zhì)量控制研究

阮建兵*，鄒文哲，金學(xué)平

(武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院 環(huán)境與生化工程系，湖北 武漢 430205)

目的：建立類風(fēng)濕膠囊的質(zhì)量控制方法。方法：采用顯微鑒別法、薄層色譜法對(duì)類風(fēng)濕膠囊中黃芪、當(dāng)歸、淫羊藿進(jìn)行定性鑒別，HPLC法對(duì)制劑中阿魏酸進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：顯微鑒別特征明顯；薄層色譜法分離度好，專屬性強(qiáng)；阿魏酸在HPLC測(cè)定中線性范圍為0.020 596～0.205 96 μg(r=0.999 5)，平均加樣回收率為98.93%，RSD=0.72%(n=9)。結(jié)論：該法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，能有效進(jìn)行類風(fēng)濕膠囊的質(zhì)量控制。

類風(fēng)濕膠囊；顯微特征；薄層色譜；高效液相色譜；阿魏酸

類風(fēng)濕膠囊是醫(yī)院制劑，由黃芪、當(dāng)歸、淫羊藿等30味中藥組成，具有補(bǔ)肝益腎，補(bǔ)精益髓，通經(jīng)活血，散寒止痛，消腫化瘀，消炎鎮(zhèn)痛，提高免疫力的功能。用于風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎、紅斑狼瘡、痛風(fēng)等證候者。為控制質(zhì)量，對(duì)處方中黃芪、當(dāng)歸、淫羊藿進(jìn)行了定性鑒別，同時(shí)用HPLC法測(cè)定了制劑中阿魏酸的含量，建立了可靠、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-20ATVP高效液相色譜儀(LC-20AT四元泵，SPD-M20A檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，LC solution 色譜工作站)；CBL9960A超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀有限公司)；METTLER TOLEDOAG135型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

類風(fēng)濕膠囊(湖南省沅陵縣中醫(yī)骨傷?？漆t(yī)院制劑，批號(hào)：060301，070409，070812)；陰性對(duì)照品(自制)。

1.3 對(duì)照品及對(duì)照藥材來(lái)源

黃芪甲苷(批號(hào)：110781-200512，供鑒別用)、當(dāng)歸(批號(hào)：120927-200613，供鑒別用)、淫羊藿(批號(hào)：110737-200414，供鑒別用)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1定性鑒別

2.1.1 顯微鑒別 取類風(fēng)濕膠囊內(nèi)容物少許，水合氯醛透化，稀甘油裝片，顯微鏡下觀察：不規(guī)則碎塊，淡灰黃色，表面及周圍擴(kuò)散出眾多細(xì)小顆粒，久置溶化。不規(guī)則碎片淡灰黃色，半透明，滲出油滴，加熱后油滴溶化，現(xiàn)正方形草酸鈣結(jié)晶。石細(xì)胞長(zhǎng)方形或類方形，壁稍厚。草酸鈣針晶成束或散在，長(zhǎng)20～90 μm。

2.1.2 黃芪薄層色譜鑒別 取類風(fēng)濕膠囊內(nèi)容物20 g，置圓底燒瓶中，加甲醇40 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液加于中性氧化鋁柱(100～120目，5 g，內(nèi)徑10～15 mm)上，用40%甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，用水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液；用水洗滌2次，每次20 mL；棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL溶解，作為供試品溶液。同法制得缺黃芪的陰性對(duì)照品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成1 mg·mL-1溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述溶液：陰性對(duì)照溶液5 μL、供試品溶液10 μL、對(duì)照溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[1-3]。供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點(diǎn)；紫外光燈(365 nm)下顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)[4]；陰性對(duì)照品無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

1.陰性對(duì)照；2.供試品(批號(hào)：060301)；3.供試品(批號(hào)：070409)；4.供試品(批號(hào)：070812)；5.黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)：110781-200512)圖1 類風(fēng)濕膠囊中黃芪薄層色譜圖

2.1.3 當(dāng)歸薄層色譜鑒別 取類風(fēng)濕膠囊內(nèi)容物5 g于圓底燒瓶，加乙醚20 mL，浸泡20 min，濾過(guò)，濾液加1%碳酸氫鈉溶液20 mL，振搖，棄去乙醚液，堿液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 2～3，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液[1]。同法制得缺當(dāng)歸的陰性對(duì)照品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述溶液：陰性對(duì)照品溶液5 μL、供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙醚-醋酸(10∶10∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。置紫外光燈(365 nm)下檢視[1-2]。供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照品無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

1.陰性對(duì)照；2.供試品(批號(hào)：060301)；3.供試品(批號(hào)：070409)；4.供試品(批號(hào)：070812)；5.當(dāng)歸對(duì)照品(批號(hào)：120927-200613)圖2 類風(fēng)濕膠囊中當(dāng)歸薄層色譜圖

2.1.4 淫羊藿薄層色譜鑒別 取類風(fēng)濕膠囊內(nèi)容物10 g于圓底燒瓶中，加70%乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，水浴蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加水飽和的正丁醇萃取2次，每次15 mL，合并正丁醇萃取液，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次10 mL，棄去水層，正丁醇液置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液[5]。同法制得缺淫羊藿的陰性對(duì)照品溶液。另取淫羊藿苷對(duì)照品加甲醇制成1 mg·mL-1溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述溶液：陰性對(duì)照溶液5 μL、供試品溶液10 μL、對(duì)照溶液5 μL分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-丁酮-水(10∶1∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。置紫外光燈(365 nm)下檢視[1-3]。供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的暗紅色熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照品無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

1.陰性對(duì)照；2.供試品(批號(hào)：060301)；3.供試品(批號(hào)：070409)；4.供試品(批號(hào)：070812)；5.淫羊藿對(duì)照品(批號(hào)：110737-200414)圖3 淫羊藿薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Dikma Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(30∶70)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；進(jìn)樣量：5 μL[6]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究表明在此色譜條件下類風(fēng)濕膠囊樣品和阿魏酸對(duì)照品分離良好，按阿魏酸峰計(jì)理論塔板數(shù)不低于8 000。

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱取阿魏酸對(duì)照品10.34 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，再取5 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.010 34 mg·mL-1阿魏酸對(duì)照溶液。

2.2.2.2 供試品溶液配制 精密稱取類風(fēng)濕膠囊內(nèi)容物5.0 g，精密加70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率160 W，頻率50 kHz，60 min)，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.2.3 陰性對(duì)照溶液的配制 依供試品制備方法制備缺當(dāng)歸的陰性樣品，照供試品溶液制備方法同法操作，制得陰性對(duì)照液。

2.2.3 陰性干擾試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各5 μL，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照溶液對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，見(jiàn)圖4～6。

圖4 阿魏酸對(duì)照品HPLC圖

圖5 類風(fēng)濕膠囊樣品HPLC圖

圖6 阿魏酸陰性對(duì)照品HPLC圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取阿魏酸對(duì)照品4.14，10.34，20.68，31.02，41.36 mg，分別置 50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，再取5 mL 置 100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.004 14，0.010 34，0.020 68，0.031 02，0.041 36 mg·mL-1阿魏酸對(duì)照溶液。分別精密吸取5份不同濃度的阿魏酸對(duì)照溶液5.0 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=5 639 401.283X-2 491.366(r=0.999 5)。進(jìn)樣量在0.020 596～0.205 96 μg呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 按上述色譜條件，用同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次5 μL，分別測(cè)得阿魏酸峰面積，RSD=0.57%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別在0，2，4，8，10，12 h時(shí)進(jìn)樣5 μL，測(cè)定阿魏酸峰面積，RSD=1.05%，表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按供試品溶液制備方法，平行制備6份，依2.2.1色譜條件試驗(yàn)，測(cè)定阿魏酸含量，6份樣品含量的RSD=1.38%，表明本法的重現(xiàn)性好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 稱取類風(fēng)濕膠囊內(nèi)容物(阿魏酸含量：0.165 5 mg·g-1)約2.5 g，共9份，按供試品溶液制備方法制備供試液，分3組，分別精密加入阿魏酸對(duì)照品溶液(0.4 mg·mL-1)0.8，1.0，1.2 mL，混勻，依法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取060301，070409，070812 3批樣品，按供試品溶液制備方法制備，依2.2.1色譜條件試驗(yàn)，測(cè)定阿魏酸含量，結(jié)果分別為0.165 3，0.165 0，0.166 1 mg·g-1。

表1 類風(fēng)濕膠囊中阿魏酸加樣回收試驗(yàn)

3 討論

類風(fēng)濕膠囊為醫(yī)院制劑，由于處方量大、成分復(fù)雜，其質(zhì)量控制必須選擇多項(xiàng)指標(biāo)。本法采用顯微觀察和薄層色譜相結(jié)合的方法進(jìn)行定性鑒別。顯微鑒別發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕膠囊內(nèi)容物特征明顯。用薄層色譜法對(duì)處方中黃芪、當(dāng)歸、淫羊藿進(jìn)行鑒別，采用不同的展開(kāi)劑和層析條件，實(shí)現(xiàn)了特征斑點(diǎn)的較好分離，斑點(diǎn)清晰。

HPLC法測(cè)定類風(fēng)濕膠囊中阿魏酸的含量，采用Dikma Diamonsil C18柱，以甲醇-0.1%磷酸溶液(30∶70)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm，研究表明阿魏酸進(jìn)樣量在0.020 596～0.205 96 μg線性關(guān)系良好(r=0.999 5)，平均加樣回收率為98.93%，RSD=0.72%，且準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好。

實(shí)驗(yàn)建立的質(zhì)量控制方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可作為類風(fēng)濕膠囊質(zhì)量控制方法。

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QualityControlResearchofRheumatoidArthritisCapsules

RUAN Jian-bing*, ZOU Wen-zhe, JIN Xue-ping

(EnvironmentandBiochemicalEngineeringDepartment,WuhanVocationalCollegeofSoftwareandEngineering,Wuhan430205,China)

Objective：To set up a method for the quality control of rheumatoid arthritis capsules.Methods: Microscopic features and thin-layer chromatography was used to indentify Milkvetch root, Angelica sinensis and Epimedium brevicornu Maxim. in rheumatoid arthritis capsules. HPLC was used to determine ferulic acid content in rheumatoid arthritis capsules.Results: The microscopic features of rheumatoid arthritis capsules were obvious. The method of TLC showed a good separation and strong specificity. Ferulic acid content showed a good linear relationshi Pwithin the range of 0.020 596～0.205 96 μg (r=0.999 5). The average recovery was 98.93%, and RSD was 0.72% (n=9).Conclusion: The established method is specific, accurate and reproducible, which can be used for the quality control of rheumatoid arthritis capsules.

Rheumatoid arthritis capsules; Microscopic features; TLC; HPLC;Ferulic acid

2012-06-07)

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阮建兵，Tel:(027)81655007，E-mail：ruanjianbing@163.com