載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球?qū)θ藢m頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用研究

陳道楨，王常在，陳萬(wàn)瑛，李向東，劉 樓，張 婷，陳 鈺，鄒 萍

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫婦幼保健院，江蘇 無(wú)錫214002；2.新疆阿合奇縣人民醫(yī)院，新疆克州843500）

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量的研究已證明20（S）－人參皂苷Rg3在腫瘤治療方面有廣闊的應(yīng)用前景［1－3］。但傳統(tǒng)制劑的臨床應(yīng)用目前仍存在不少問(wèn)題，如顆粒偏大、不溶于水，生物利用度較低等等，極大限制了其臨床應(yīng)用。本研究采用納米技術(shù)，制備了載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球并觀察了載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球（SPG－Rg3－HAS－NP）對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞體外增殖抑制作用。

1 材料和方法

1.1 試劑

人宮頸癌Hela細(xì)胞株購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）；20（S）－人參皂苷Rg3購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度≥97%，人血清白蛋白購(gòu)自上海生工生物科技有限公司：胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco BRL公司產(chǎn)品，二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）為美國(guó)Pharmingin公司產(chǎn)品，用磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解成5g/L，避光儲(chǔ)存于4℃；其余試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器

BS－110S型電子天平（德國(guó)Sartorius公司），GL－2型恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）.；SB5200型超聲波（上海Branson公司），MM1微型振蕩器（上海精密生化儀器廠），CO2培養(yǎng)箱（三洋公司），B10－Rad 550酶標(biāo)儀（日本）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌Hela細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，各培養(yǎng)液中均常規(guī)加入10%胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/ml。

1.4 SPG－Rg3的配制

將SPG－Rg3粉末用DMSO溶解，用含10%新生胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成實(shí)驗(yàn)所需的各種不同濃度，DMSO終濃度＜0.01%。

1.5 載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球（SPGRg3－HAS－NP）制備

采用乳化熱固化法制備載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球，該法正在申報(bào)國(guó)家專利。同時(shí)制備空白白蛋白納米粒（HAS－NP）［4］。納米粒使用前均經(jīng)60鈷輻射消毒備用。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)

①實(shí)驗(yàn)分組：A：生理鹽水對(duì)照組；B：空白白蛋白納米粒（HAS－NP）組；C：20（S）－人參皂苷組（SPG－Rg3）；D：載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球組（SPG－Rg3－HAS－NP）；其中B和D組白蛋白濃度一致，C和D組SPG－Rg3藥物濃度一致。②用藥濃度（按照所包 Rg3計(jì)算）：10、20、40、80、160 μg/ml。③觀察時(shí)間：給藥后24h、48h、72h和96 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。④MTT實(shí)驗(yàn)：將人宮頸癌Hela細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 （1.5×104個(gè)細(xì)胞/孔），置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24h后，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好時(shí)，按照是實(shí)驗(yàn)分組給藥，每個(gè)濃度級(jí)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。給藥后分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h和96h，每孔加入MTT溶液50μl（1mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h；加入150μl/孔DMSO溶解沉淀，微型振蕩儀振蕩10min混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)吸光度（OD）值，取3孔吸光度平均值。以不加任何細(xì)胞的一孔為空白調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較采用方差分析q檢驗(yàn)；多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組均數(shù)間的比較采用方差分析q’檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空白白蛋白納米粒的細(xì)胞毒性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在24h、48h、72h和96h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，空白白蛋白納米粒（HAS－NP）組對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率與生理鹽水組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），與SPG－Rg3組和 SPG－Rg3－HAS－NP組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），故可以認(rèn)為不含藥白蛋白納米微球?qū)ela細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒作用，且不具有時(shí)間和濃度依賴性。故可認(rèn)為這種抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)作用是由于SPG－Rg3或SPG－Rg3－HASNP釋放出的SPG－Rg3作用的結(jié)果造成的。

2.2 Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與藥物濃度和作用時(shí)間相關(guān)性

MTT法檢測(cè)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與藥物濃度和作用時(shí)間相關(guān)性結(jié)果見(jiàn)（圖1和圖2）。從圖可以看出，給藥24h、48h、72h和96h后，SPG－Rg3和SPGRg3－HAS－NP組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均與給藥濃度呈正相關(guān)，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制率仍繼續(xù)增加。說(shuō)明Hela細(xì)胞生長(zhǎng)分別與兩組藥物的給藥濃度和時(shí)間呈一定的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。

2.3 Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的組間差異比較

圖3A和3B顯示，在24h、48h時(shí)SPG－Rg3組各濃度值下的細(xì)胞抑制率高于SPG－Rg3－HAS－NP組細(xì)胞抑制率，但兩組細(xì)胞抑制率相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而在72h后，SPG－Rg3－HAS－NP組在各個(gè)濃度點(diǎn)的細(xì)胞抑制率均明顯超過(guò)SPGRg3組的細(xì)胞抑制率，且兩組細(xì)胞抑制率相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3C）；SPG－Rg3組在80μg/ml濃度以后似已進(jìn)入平臺(tái)期甚至出現(xiàn)曲線下行的趨勢(shì)，而SPG－Rg3－HAS－NP組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線仍繼續(xù)上升，72h后于20μg/ml濃度處抑制率已超過(guò)SPG－Rg3組（P＜0.05）（圖3C、3D）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SPG－Rg3－HAS－NP組藥物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制有一定的時(shí)間延續(xù)性，表明藥物具有一定的緩釋作用。

圖1 Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與SPG－Rg3濃度和作用時(shí)間的相關(guān)性

圖2 Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與SPG－Rg3－HAS－NP濃度和作用時(shí)間的相關(guān)性

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)SPG－Rg3與SPG－Rg3－HAS－NP濃度和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的相關(guān)性

3 討論

納米藥物是指以納米級(jí)高分子納米粒（nanoparticles，NP）或納米球（nano－spheres，NS）、納米囊（nano－capsules，NC）等為載體，與藥物以一定方式結(jié)合在一起后制成的藥物［5］。運(yùn)用納米技術(shù)的藥物可以克服傳統(tǒng)藥物許多缺陷以及無(wú)法解決的問(wèn)題。與常規(guī)藥物相比，納米藥物顆粒小、表面反應(yīng)活性高、活性中心多、催化效率高、吸附能力強(qiáng)，因此，它具有許多常規(guī)藥物不具備的優(yōu)點(diǎn)［6］：①能增大藥物溶解度和吸收利用度，減少藥物用量，減輕或消除毒副作用并節(jié)省藥物資源。②納米顆粒作為生物大分子的載體，能改善蛋白質(zhì)、多肽類大分子等口服藥物的吸收和生物利用度。③納米藥物可以實(shí)現(xiàn)緩釋、控釋和靶向治療。目前，已有多篇文章報(bào)道，將傳統(tǒng)藥物納米化后，藥效大大提高，在抗腫瘤研究中顯示了充分的優(yōu)越性。如紫杉醇納米顆粒能明顯減小腫瘤體積，延長(zhǎng)動(dòng)物存活時(shí)間，與等劑量的游離型紫杉醇相比，抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)［7］。納米化的砒霜和雄黃與傳統(tǒng)劑型相比，抗腫瘤療效均明顯增強(qiáng)［8］。

本研究采用MTT法觀察了給予不同濃度20（S）－人參皂苷和載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果顯示，SPG－Rg3和SPG－Rg3－HAS－NP對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞均具有顯著的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，且Hela細(xì)胞生長(zhǎng)分別與兩組藥物的給藥濃度和時(shí)間呈一定的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。SPG－Rg3組在80μg/ml濃度以后似已進(jìn)入平臺(tái)期甚至出現(xiàn)曲線下行的趨勢(shì)，而SPG－Rg3－HAS－NP組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線仍繼續(xù)上升，72h后于20μg/ml濃度處抑制率已超過(guò)SPG－Rg3組（P＜0.05）。提示SPGRg3－HAS－NP組藥物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制有一定的時(shí)間延續(xù)性，表明載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球具有一定的緩釋作用。這與白蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)以及白蛋白納米微球的生物特性有很大的關(guān)系。白蛋白分子中的氨基酸以肽鍵相連，且扭曲成團(tuán)裝，具網(wǎng)狀空隙，有利于攜帶20（S）－人參皂苷藥物，同時(shí)白蛋白由于有較低的免疫原性和可生物降解的特點(diǎn)，可致載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球具有緩釋藥物的特點(diǎn)［9］。

由于體內(nèi)外環(huán)境的巨大差異，本實(shí)驗(yàn)只初步檢測(cè)了20（S）－人參皂苷和載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球在體外對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用的藥效作用方面是否有明顯減損，與原藥相比，載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球在藥物緩釋和生物利用度方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，但難以體現(xiàn)其更多的劑型優(yōu)勢(shì)，比如載藥白蛋白納米微球在動(dòng)物體內(nèi)的組織滯留性以及靶器官的藥物濃度和作用時(shí)間等方面都需要在今后的體內(nèi)試驗(yàn)中進(jìn)一步加以研究。治療。

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