傳統(tǒng)發(fā)酵飲料博扎中酵母菌的分離和鑒定

吾爾恩·阿合別爾迪，楊曉絨，木古麗，焦子偉

（伊犁師范學(xué)院 化學(xué)與生物學(xué)院，新疆 伊寧 835000）

博扎（柯爾克孜語勃左）是一種用小米粉自然發(fā)酵而成的發(fā)酵飲料，其制作和保藏工藝天然傳統(tǒng)，是一種酒精度低、糖度低、質(zhì)地濃稠的天然發(fā)酵飲料。博扎的起源可追溯到居住于前奧托曼土耳其的古老民族，作為一種健康飲品延續(xù)至今，不僅在其原產(chǎn)地仍然盛行，而且廣泛傳播至美洲、亞洲等地區(qū)，至今只有在我國新疆部分地區(qū)的柯爾克孜族家庭中仍保留著制作和飲用博扎的習(xí)慣[1]。

長期飲用博扎可助消化，治療胃病、高血壓、冠心病等。博扎含酒精很低，既有醪糟的長處，又有啤酒的優(yōu)點(diǎn)。從釀制、用料、加工到酒的形態(tài)都和醪糟都很相似[2]。

目前含醇飲料的消費(fèi)趨勢已經(jīng)向低醇化、營養(yǎng)化及功能化方向發(fā)展，因此應(yīng)擴(kuò)大和加強(qiáng)對博扎，尤其是對其微生物成分的研究，可豐富我國益生菌資源庫。有關(guān)博扎中微生物成分的報(bào)道較少，努爾古麗·熱合曼等[1]報(bào)道博扎中有植物乳桿菌（Lactobacterium plantarum）、短乳桿菌（Lac tobacillus brevis）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巴氏醋酸桿菌（Acetobacerpasteurianus）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等微生物成分。因?yàn)樽匀画h(huán)境和工藝制作的差異、原料的不同，各地區(qū)博扎中微生物種類可能也不同。從伊寧市三家博扎店采3個(gè)樣品，分離和鑒定其中的酵母菌對博扎的研制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法[3]

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

采自新疆伊寧市塔爾米為原料的市售博扎，采集后置于4℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基[4-13]

酵母菌富集培養(yǎng)基，馬丁氏培養(yǎng)基，豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基，麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基，玉米粉瓊脂培養(yǎng)基，葡萄糖（乳糖、蔗糖）發(fā)酵培養(yǎng)基，油脂培養(yǎng)基，明膠液化培養(yǎng)基，硝酸鹽還原試驗(yàn)培養(yǎng)基，石蕊牛奶培養(yǎng)基，同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同化氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基等。

1.2 儀器與設(shè)備

GHP-9050隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海艾牧生物科技有限公司；YXQ-LS-T5SII型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；GRC-200恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限責(zé)任公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；FA1004-HANGPING電子天平：上海天平儀器廠；ZHJH-2109C水平流超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司；MC-SP21105多功能電磁爐：廣州美的生活電器制造有限公司；揚(yáng)天T2900D微型計(jì)算機(jī)：聯(lián)想（北京）有限公司；SFC-288生物顯微鏡：麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分離純化酵母菌

首先通過酵母菌富集培養(yǎng)基，于28℃富集培養(yǎng)24h。然后將富集培養(yǎng)后的菌株接入馬丁氏培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)后長出的單個(gè)菌落分別挑取少許菌苔接種在豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基的斜面上純化，純化2～3次，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酵母菌的鑒定

酵母菌的鑒定程序、方法參考文獻(xiàn)[6，14-15]。

酵母菌的形態(tài)觀察：

（1）菌落特征的觀察

肉眼觀察生長在豆芽汁葡萄糖平板上的酵母菌菌落，根據(jù)菌落大小，菌落顏色，菌落形態(tài)進(jìn)行描述。

（2）觀察出芽生殖

在載玻片上滴1滴蒸餾水，挑取少量酵母放入蒸餾水中，制成臨時(shí)裝片，觀察菌體細(xì)胞的大小與出芽方式。

（3）觀察子囊孢子

①將酵母接種于豆芽汁培養(yǎng)基中，于28℃～30℃培養(yǎng)24h，然后連續(xù)傳代3～4次，最后轉(zhuǎn)接到麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基，在25℃～28℃培養(yǎng)3d左右，使其形成子囊孢子；

②從形成子囊孢子的菌落中，取出少量菌體，在載玻片上制作涂片，干燥、固定后，在涂菌處滴5%孔雀綠染液，10min后用水沖洗，再用0.5%番紅染液復(fù)染1min；

③將涂片置于顯微鏡下，觀察子囊孢子的形狀、特點(diǎn)。（4）假菌絲形成

新培養(yǎng)物劃線接種于玉米瓊脂培養(yǎng)基上，25℃～28℃培養(yǎng)3d～5d，制成臨時(shí)裝片，置于顯微鏡下觀察。

酵母菌生理生化特征檢測：

（1）糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

糖類選用葡萄糖、蔗糖、乳糖制備培養(yǎng)基，用1.6%溴甲酚紫溶液將培養(yǎng)基調(diào)至紫色，115℃、30min滅菌（滅菌后加10%糖液），接種，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，另一支管不接種作為對照，觀察酵母菌對不同糖類的發(fā)酵產(chǎn)酸能力。

（2）油脂水解實(shí)驗(yàn)

配制油脂培養(yǎng)基時(shí)，預(yù)先加入中性紅指示劑或溴甲酚紫指示劑來完成檢驗(yàn)，將油脂固體培養(yǎng)基融化后，充分振蕩（使油脂分布均勻）傾入無菌空白培養(yǎng)皿，凝固后制成平板，接種，培養(yǎng)48h，觀察培養(yǎng)基中的脂肪是否被分解。

（3）碳源同化測定

使用生長譜法測定碳源同化。

①制備菌懸液：3mL～5mL無菌生理鹽水倒入斜面，洗下菌苔，4000r/min離心15min，加無菌生理鹽水洗滌，4000r/min離心30min，最后用無菌生理鹽水10mL，制成菌懸液，30℃振蕩培養(yǎng)24h；

②制混菌平板：取1mL菌懸液和融化后冷卻至50℃左右的基礎(chǔ)培養(yǎng)基傾注于無菌培養(yǎng)皿中，制成混菌平板，于30℃培養(yǎng)3h。平板底面預(yù)先劃區(qū)，標(biāo)記滴加的糖類名稱；

③加糖液：取出培養(yǎng)3h的混菌平板，用浸泡過葡萄糖、蔗糖、乳糖的小圓濾紙片，分別放在平板上已劃分好的位置上，30℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察酵母菌對不同碳源的利用情況。

（4）氮源同化測定

生長譜法測定氮源同化：①制備菌懸液②制混菌平板③培養(yǎng)基中分別加入0.78%硝酸鉀、0.78%硫酸銨，接種，30℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察酵母菌對不同氮源的利用情況。

制備明膠培養(yǎng)基，用穿刺法接種酵母菌，置于20℃～22℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)4d～5d，觀察培養(yǎng)后的明膠培養(yǎng)基的變化。

（5）硝酸鹽還原試驗(yàn)

將酵母菌接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，將3支管置于37℃恒溫箱，培養(yǎng)1d、3d、5d，另外一支管不接種作對照。取干凈的空試管，在試管中倒入少許培養(yǎng)基液，再滴一滴A液及B液，在對照管中同樣加入A、B液各一滴，觀察顏色反應(yīng)（溶液如變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色、橙色、棕色等表示有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性）。

（6）明膠液化試驗(yàn)

利用明膠作為凝固劑的培養(yǎng)基，用穿刺法接種酵母菌，置于20℃～22℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)4d～5d，觀察培養(yǎng)后的明膠培養(yǎng)基的變化。

（7）牛奶胨化試驗(yàn)

①配制牛奶石蕊培養(yǎng)基：脫脂牛奶粉100g，石蕊0.075g，蒸餾水1000mL，混合后的顏色呈丁香花紫色為適度，pH6.8，121℃滅菌15min。

②分裝試管，接種，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)7d，另外保留一支不接種的石蕊牛奶培養(yǎng)基作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的個(gè)體形態(tài)學(xué)特征觀察結(jié)果

將自然發(fā)酵飲料博扎的10-4、10-5和10-63個(gè)濃度的稀釋液經(jīng)富集培養(yǎng)后，在馬丁氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，再在豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，純化2次，觀察菌落特征，借助顯微鏡來觀察酵母菌的出芽生殖及假菌絲，再對其進(jìn)行接代培養(yǎng)，結(jié)合顯微鏡觀察子囊孢子，結(jié)果見表1。

表1 菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)結(jié)果Table 1 Results of colony shape and cellular morphology

酵母菌的個(gè)體形態(tài)大小、出芽方式、能否產(chǎn)生假菌絲以及子囊孢子形成能力，是酵母菌鑒定的重要依據(jù)。結(jié)果顯示，酵母菌大多呈圓形、卵圓形、橢圓形，長約5.4μm，Y4、Y6、Y9、Y10均產(chǎn)生了菌絲，Y3、Y5、Y11均能產(chǎn)生卵圓形子囊孢子，Y1、Y2、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y12未能觀察到子囊孢子的形成。

2.2 酵母菌的生理生化特征測定結(jié)果

2.2.1 酵母菌的糖發(fā)酵結(jié)果

分別選取葡萄糖、蔗糖、乳糖進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 酵母菌的糖發(fā)酵結(jié)果Table 2 Results of yeast sugar fermentation test

從表2可以看出，菌株Y3、Y5、Y11發(fā)酵能力較好，Y1、Y2、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12僅對葡萄糖有發(fā)酵能力。

2.2.2 油脂水解的測定結(jié)果

在配制油脂培養(yǎng)時(shí)，預(yù)先加入中性紅指示劑來完成產(chǎn)生脂肪酸的檢驗(yàn)。經(jīng)接種培養(yǎng)24h后，觀察平板底層長菌處。結(jié)果有平板底層長菌處有紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)，則表示酵母菌產(chǎn)生了脂肪酶，將培養(yǎng)基中的脂肪分解為甘油及脂肪酸，此為正反應(yīng)。說明所有酵母菌菌株具有分解脂肪的能力。

2.2.3 同化能力的測定結(jié)果

各株酵母菌對不同碳源、氮源的利用能力差異明顯，結(jié)果見表3。

由表3可以看出，12株酵母菌對不同碳源、氮源的利用能力有差異，菌株Y1、Y2、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y12碳源同化葡萄糖、蔗糖，不同化乳糖，Y5、Y11碳源同化能力較弱，同化葡萄糖，不同化蔗糖、乳糖。菌株Y3、Y5、Y4、Y6、Y9、Y10、Y11氮源同化硫酸銨，不同化硝酸鉀，Y1、Y2、Y7、Y8、Y12氮源同化能力較強(qiáng)。

表3 酵母菌的碳源、氮源同化結(jié)果Table 3 Assimilation results of yeast carbon and nitrogen source test

2.2.4 硝酸鹽還原試驗(yàn)測定結(jié)果

硝酸鹽還原是指能把培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，培養(yǎng)基中加入格里斯試劑時(shí)，溶液呈現(xiàn)粉紅色、棕色、橙色、玫瑰色等。對12株菌株進(jìn)行硝酸鹽還原測定，菌株Y1、Y2、Y7、Y8、Y12培養(yǎng)基溶液呈現(xiàn)玫瑰紅色，菌株Y3、Y5、Y11培養(yǎng)基溶液呈現(xiàn)橙色，菌株Y4、Y6、Y9、Y10培養(yǎng)基溶液呈現(xiàn)棕色。結(jié)果顯示均有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性。

2.2.5 明膠液化試驗(yàn)的測定結(jié)果

明膠培養(yǎng)基經(jīng)酵母菌利用后，均由原來的固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)，說明酵母菌具有分解明膠的能力，能向外分泌蛋白酶，分解明膠而產(chǎn)生小分子物質(zhì)。

2.2.6 牛奶胨化實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果

酵母菌對牛奶的利用主要是指對乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中加入石蕊作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑，石蕊中性時(shí)呈淡紫色，酸性時(shí)呈紅色，堿性時(shí)呈藍(lán)色，還原時(shí)則部分或全部脫色。對12株菌株進(jìn)行牛奶胨化培養(yǎng)，均呈現(xiàn)橙紅色，說明酵母菌發(fā)酵乳糖后產(chǎn)酸，使石蕊牛乳變紅。酵母菌具有發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸能力。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，Y1、Y2、Y7、Y8、Y12菌株細(xì)胞圓形或卵圓形，為兩段芽殖，無子囊孢子；其發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵蔗糖、乳糖；碳源同化葡萄糖、蔗糖，不同化乳糖；氮源同化硝酸鉀和硫酸銨；牛奶反應(yīng)陽性；明膠液化陽性；硝酸鹽還原陽性。綜合該菌以上特征，根據(jù)《The Yeast，A Taxonomic Study》[8]初步鑒定為真菌門半知菌亞門，芽孢菌綱隱球酵母目，隱球酵母科隱球酵母屬（Cryptococcus）。

Y4、Y6、Y9、Y10菌株細(xì)胞卵圓形或圓形，兩端芽殖，液具環(huán)，無子囊孢子；玉米粉培養(yǎng)基載玻片培養(yǎng)時(shí)，可見大量的假菌絲；發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，不發(fā)酵乳糖；碳源同化葡萄糖、蔗糖，不同化乳糖；氮源同化硫酸銨，不同化硝酸鉀；牛奶反應(yīng)陽性；油脂分解；明膠液化陽性。綜合該菌以上特征，根據(jù)D亞羅《酵母菌的特征與鑒定手冊》[6]初步鑒定為真菌門半知菌亞門，芽孢菌綱隱球酵母目，隱球酵母科假絲酵母屬（Candida）。

Y3、Y5、Y11菌株細(xì)胞圓形或卵圓形，周邊芽殖，有1～4個(gè)子囊孢子；發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，不發(fā)酵乳糖；碳源同化葡萄糖、蔗糖，不同化乳糖；氮源同化硫酸銨，不同化硝酸鉀；牛奶反應(yīng)陽性；明膠液化陽性；油脂分解。綜合該菌以上特征，根據(jù)J.A.尼巴特《酵母菌的特征與鑒定手冊》[9]初步鑒定為真菌門子囊菌亞門，子囊菌綱內(nèi)孢霉目，內(nèi)孢霉科釀酒酵母屬（Scerevisiae）。

[1]努爾古麗·熱合曼，華長春，朱曉瑩，等.新疆柯爾克孜族傳統(tǒng)發(fā)酵飲料博扎中微生物群落結(jié)構(gòu)的PCR-DGGE分析[J].食品科學(xué)，2012，33（1）：111-114.

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