高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定辣椒制品中的10種工業(yè)染料

龍四紅，梁桂娟*，李紅洲，肖 洋，孫 棣

（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州 貴陽(yáng) 550003）

工業(yè)染料是用于紡織品、皮革制品及木制品的染色的物質(zhì)，因價(jià)格便宜、著色強(qiáng)、穩(wěn)定性強(qiáng)，所以也被不法商販用作替代食品染料的著色劑。非法添加到食品中而被廣為熟悉的工業(yè)染料包括蘇丹紅、羅丹明B、堿性橙、堿性嫩黃、酸性橙等。工業(yè)染料都是具有一定毒性的化學(xué)品，很多具有高毒性、高殘留和“三致”等副作用，添加了工業(yè)染料的食品會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重的危害。2008年12月衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中明確將蘇丹紅、羅丹明B（玫瑰紅B）、堿性嫩黃等工業(yè)染料列入非食用物質(zhì)名單。

在眾多的工業(yè)染料中，僅蘇丹紅、羅丹明B等少數(shù)幾種物質(zhì)有國(guó)家或行業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[1-5]，文獻(xiàn)報(bào)道的也大多數(shù)是采用高效液相色譜法檢測(cè)[6-9]。由于辣椒制品中基質(zhì)較為復(fù)雜，用高效液相色譜法容易出現(xiàn)干擾峰，從而給結(jié)果的判定造成困擾。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)等的特點(diǎn)[10-15]，本研究旨在針對(duì)辣椒制品中容易被非法添加的10種工業(yè)染料，建立準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快捷的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法，為食品質(zhì)量監(jiān)管部門提供準(zhǔn)確、及時(shí)的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、堿性嫩黃標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥97%）、羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥97%）、酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ（純度分別≥90.5%、90.0%、96.0%、92.0%）標(biāo)準(zhǔn)品：Dr.Ehrensforfer GmbH Germany公司。

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）等試劑：德國(guó)Merck公司。

辣椒制品樣品：購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ QUANTUM ULTRA高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo公司；Mnltireax振蕩混勻器：德國(guó)Heidolph公司；Allegra X-22R冷凍離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.1g（精確至0.0001g）堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22、堿性嫩黃O、羅丹明B、酸性橙Ⅱ、SUDANⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品。堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22、堿性嫩黃O、羅丹明B、酸性橙Ⅱ用10mL水溶解后用乙腈定容至100mL；蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ用乙腈溶解并定容至100mL，分別配制成1mg/mL的各目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱取經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎并混合均勻的樣品2g（精確到0.01g），置于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入10mL乙腈均質(zhì)30s后充分振蕩提取20min，8000r/min、低溫（5℃）離心5min，上清液過(guò)0.22μm濾膜待測(cè)。

1.3.3 空白基質(zhì)工作使用溶液的配制

稱取2g（精確到0.01g）空白辣椒制品，加入不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，按1.3.2的樣品處理方法進(jìn)行操作，使得空白樣品中10種工業(yè)染料的最終濃度為0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。

1.3.4 儀器條件

液相色譜條件：液相色譜柱Thermo Hypersil GOLD（100mm×2.1mm，粒徑 3μm）；柱溫30℃；流速400μL/min；進(jìn)樣量10μL；梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 program of gradient elution

質(zhì)譜條件：正離子模式（electrospray ionization，ESI+）和負(fù)離子模式（electrospray ionization，ESI-）同時(shí)采集，噴霧電壓3000V，蒸發(fā)氣溫度350℃，離子傳輸毛細(xì)管溫度270℃，鞘氣壓力4.5MPa，輔助氣壓力0.5MPa，掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（select reaction monitoring，SRM）。各目標(biāo)物質(zhì)定性定量離子對(duì)及優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

1.3.5 樣品測(cè)定

將上述空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣液在1.3.4的儀器條件下，用HPLC-MS/MS方法測(cè)定。

1.3.6 定性及定量

表2 10種工業(yè)染料的質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrometric conditions of ten kinds of dyes

在表2儀器條件下對(duì)基質(zhì)加標(biāo)溶液和樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和定性定量離子所對(duì)應(yīng)色譜峰面積的相對(duì)豐度進(jìn)行定性。要求待測(cè)化合物的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中化合物的保留時(shí)間一致（標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%），同時(shí)要求待測(cè)試樣中目標(biāo)化合物的定性定量離子所對(duì)應(yīng)的色譜峰面積之比與標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的定性定量離子所對(duì)應(yīng)的色譜峰面積之比一致，即當(dāng)相對(duì)豐度＞50%、20%～50%、10%～20%、＜10%時(shí)，容許偏差分別為20%、25%、30%和50%。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)定量離子對(duì)的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的確定

為探索簡(jiǎn)便、快速、適用范圍廣且回收率高的前處理方法，本研究對(duì)提取溶劑、提取時(shí)間等進(jìn)行了探索。對(duì)比了不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇/水、乙腈/水對(duì)樣品的提取效率，發(fā)現(xiàn)純乙腈對(duì)10種染料的綜合提取率最高且在20min后提取率達(dá)到最大。因此選擇乙腈作為10種工業(yè)染料的提取溶劑。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)研究的10種目標(biāo)物質(zhì)中，酸性橙Ⅱ采用負(fù)離子模式，其余9種采用正離子模式，因此選擇正負(fù)離子同時(shí)采集模式，掃描模式采用SRM選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。通過(guò)在流動(dòng)相中加酸后發(fā)現(xiàn)，7種正離子模式采集的物質(zhì)靈敏度均有較大幅度的提高，而對(duì)負(fù)離子模式采集的酸性橙Ⅱ影響不明顯。對(duì)比了0.1%甲酸水-甲醇，0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈后，發(fā)現(xiàn)從分離時(shí)間、分離效果，靈敏度等方面，0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈都要優(yōu)于前二者，故采用0.1甲酸水-0.1%甲酸乙腈的流動(dòng)相體系。各目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 10種工業(yè)染料物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of ten kinds of industry standard dyes

2.3 10種染料物質(zhì)的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及其檢出限

為消除辣椒制品帶來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)影響，采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方式制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)空白基質(zhì)加標(biāo)工作溶液在1.3.4的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，得到其線性方程及相關(guān)系數(shù)。按信噪比S/N=3以及本方法的定容體積和取樣量，計(jì)算其檢出限。線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及其檢出限見(jiàn)表3。

表3 線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍與檢出限Table 3 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients and limit of detection(LOD)

由表3可知，10種工業(yè)染料在各自的線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.9963～0.9999，檢出限在1.0μg/kg～5.0μg/kg。

2.4 方法的回收率與精密度

對(duì)樣品進(jìn)行高、中、低3種濃度水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每一水平重復(fù)測(cè)定3次，加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 方法的回收率及重現(xiàn)性(n=3)Table 4 Results of recovery rate,relative standard deviation(RSD)

由表4可知，用該方法對(duì)辣椒制品中的10種工業(yè)染料進(jìn)行測(cè)定，加標(biāo)回收率介于71.4%～102.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，滿足方法學(xué)要求。

2.5 樣品的測(cè)定

在對(duì)40個(gè)批次的油辣椒制品檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)2個(gè)批次的樣品中檢出蘇丹紅Ⅰ，含量分別為45μg/kg和70μg/kg，1個(gè)批次檢出羅丹明B，含量為63μg/kg。

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）快速檢測(cè)食品中10種工業(yè)染料的方法。實(shí)驗(yàn)表明，該方法前處理簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)便靈敏，準(zhǔn)確快速，10種工業(yè)染料在各自的線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）在0.9963～0.9999，檢出限為1.0μg/kg～5.0μg/kg，加標(biāo)回收率為71.4%～102.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。適用于監(jiān)管部門對(duì)辣椒制品進(jìn)行日常的監(jiān)督抽查和大規(guī)模的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)。

[1]中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).GB/T 23496-2009.食品中禁用物質(zhì)的檢測(cè)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[2]浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.DB33/T 703-2008.食品和農(nóng)產(chǎn)品中多種堿性工業(yè)染料的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[3]中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫局行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).SN/T2430-2010.進(jìn)出口食品中羅丹明B的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

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