HCV多表位抗原基因pcxz的三串聯(lián)表達(dá)及其在小鼠體內(nèi)免疫原性的研究

周 平，楊桂梅，余 龍，任大明

（復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國家重點實驗室，上海200433）

丙型病毒性肝炎，是一種由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染引起的病毒性肝炎，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV的感染率約為3%，估計約1.8億人感染了HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬例.丙型肝炎呈全球性流行，可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌（HCC）.一些數(shù)據(jù)顯示，未來20年內(nèi)與HCV感染相關(guān)的死亡率（肝衰竭及肝細(xì)胞癌導(dǎo)致的死亡）將繼續(xù)增加，對患者的健康和生命危害極大，已成為嚴(yán)重的社會和公共衛(wèi)生問題.研究人員對研制有效的丙肝病毒疫苗做了很多有益的嘗試，采取了如重組病毒疫苗[1－3]、DNA疫苗[4，5]、融合蛋白疫苗[6－8]、口服疫苗[4]等策略以及新興的 RNA 干擾技術(shù)，研究的熱點從包膜蛋白、核心蛋白到現(xiàn)在的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和NS5.但目前HCV疫苗還沒有成功的報道.

現(xiàn)代疫苗學(xué)研究認(rèn)為單個表位的抗原只能誘導(dǎo)針對一種表位的免疫反應(yīng)，而利用重組的多表位抗原或合成肽表位的混合物進(jìn)行免疫可以獲得同時針對多個靶點的免疫反應(yīng).由于合成肽存在溶解度、氨基酸的化學(xué)修飾以及價格昂貴等問題，因此多表位抗原疫苗成為重要的研究方向，目前已在腫瘤[9]、艾滋病[10－11]、瘧疾[12]、丙肝[13－15]等方面進(jìn)行廣泛開展了相關(guān)研究.然而，將重組的多表位抗原進(jìn)行串聯(lián)重復(fù)形成更大分子量的多表位抗原的研究很少見報道.由于HCV的高度變異性[16]、抗HCV抗體無明顯的中和性[17]等特點，以及缺乏小動物模型[18]等因素的制約，目前還沒有有效的 HCV疫苗問世[19].陳麗珊等[14]將單拷貝的多表位PCX串聯(lián)形成3個拷貝的PCX3，發(fā)現(xiàn)與單拷貝的多表位PCX抗原相比，具有3個拷貝的PCX3能夠誘發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng).楊桂梅等[20]發(fā)現(xiàn)PCXZ比PCX3具有更強(qiáng)的免疫反應(yīng)效果，因此，在楊桂梅等[20]的基礎(chǔ)上將3段pcxz基因串聯(lián)后表達(dá)形成多表位抗原3PCXZ，并檢測了其抗原特異性等.結(jié)果表明本文合成的多表位抗原3PCXZ不僅誘導(dǎo)所免疫的BALB／c小鼠產(chǎn)生高滴度的IgG抗體反應(yīng)，而且能刺激CD4＋T細(xì)胞分泌INF－γ細(xì)胞因子以及產(chǎn)生特異性的細(xì)胞毒T細(xì)胞效應(yīng).

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、BL21（DE3），質(zhì)粒pET－28b（＋）、和pET－28b（＋）／pcxz為本實驗室保存.DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker等購自Fermentas（MBI Fermentas）；HRP－羊抗人IgG、HRP－羊抗鼠IgG購自Merck公司；Suprafuge 22型高速冷凍離心機(jī)（德國Heraeus公司）；DNA測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成.抗HCV陽性血清和正常血清由上海市第一人民醫(yī)院提供.BALB／c P815細(xì)胞來自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所.BALB／c小鼠購自上海實驗動物中心，健康6～8周齡小鼠17～21g，雄性.每組小鼠8只.

1.2 方法

1.2.1 3pcxz基因的構(gòu)建

以楊桂梅[20]構(gòu)建的pET－28b／pcxz為模板PCR擴(kuò)增帶不同酶切位點的3段pcxz片段.

表1 本文中所用PCR引物Tab.1 Primers used in this paper

PCR擴(kuò)增體系如下:ddH2O 39μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL，2.5mmol／L dNTP 2μL，10μmol／L上游引物1μL，10μmol／L下游引物1μL，質(zhì)粒pUC／pcx 1μL，Taq酶（5U／μL）1μL，總體積50μL.

上述溶液在0.25mL離心管中充分混勻后按下列條件擴(kuò)增:95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，30個循環(huán)后72℃10min.1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增條帶.產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化.片段A同pET－28b載體分別經(jīng)BamHⅠ＆EcoRⅠ雙酶切，然后兩者相連構(gòu)建pET－28b／A；提取pET－28b／A質(zhì)粒同B片段一起各經(jīng)EcoRⅠ＆SalⅠ雙酶切，再相連構(gòu)建pET－28b／AB；提取pET－28b／AB質(zhì)粒再同C片段一起分別經(jīng)SalⅠ＆XhoⅠ雙酶切，再相連構(gòu)建pET－28b／ABC即pET－28b／3pcxz.瓊脂糖凝膠電泳和測序驗證質(zhì)粒構(gòu)建的效果.

1.2.2 目的基因的原核表達(dá)及純化

目的基因的小量表達(dá):將pET－28b（＋）／3pcxz轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）菌株，另外挑E.coliBL21單菌落接種于2mL LB培養(yǎng)基中（不含抗性）作為對照.37℃搖床培養(yǎng)，OD600為0.4～0.6時，加IPTG至終濃度為1mmol／L，37℃誘導(dǎo)4h.5 000r／min離心10min，收集菌體.12%SDS－PAGE鑒定表達(dá)情況.

大量發(fā)酵表達(dá):重組菌株E.coliBL21（DE3）pET－28b（＋）／3pcxz接種于50mL的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，取5mL種子液于250mL含卡那抗性的發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)4h，用濃度為1mmol／L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后收菌.冷凍離心機(jī)4 000r／min離心15min，菌體凍于－20℃待純化.

純化:根據(jù)Ni2＋－NTA－agarose親和層析柱變性條件下的蛋白質(zhì)純化方法.凍存的菌體超聲破碎后，1 2000r／min離心20min，上清液與50%Ni2＋－NTA－agarose以4∶1的體積比混合，室溫下200r／min振蕩15～60min，將混合液加入到空的柱子中，打開柱子底部的蓋子，收集流出液，加入洗滌緩沖液洗滌后用0.5mL洗脫液F（100mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－Cl，8mmol／L Urea，pH4.5）進(jìn)行洗脫，洗脫4次.收集各步驟流出液，SDS－PAGE電泳檢測.

收集變性條件下純化的蛋白質(zhì)溶液后，先用適量的PEG20000濃縮后透析，最后進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定.

1.2.3 Western blot檢測3pcxz與抗－HCV抗體反應(yīng)的特異性

蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS－PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，經(jīng)過封閉處理后加入HCV病人陽性血清或正常人血清（含5%脫脂奶粉PBS 1／50稀釋），37℃振蕩2h，用PBST（含有1／1 000Tween20的PBS）洗滌后加入HRP－羊抗人IgG（5%脫脂奶粉PBST稀釋），37℃振蕩2h，PBST洗滌后加入反應(yīng)液顯色.

1.2.4 免疫

6到8周齡的BALB／c小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只.將純化的3PCXZ抗原用適量的PBS稀釋后，加等體積的完全弗氏佐劑（CFA）乳化或無佐劑，用于皮下多點注射BALB／c小鼠，免疫量分別為50μg／只.之后于第3，5周取相同劑量的3PCXZ抗原用適量的PBS稀釋后，加等體積的不完全佐劑或無佐劑各免疫1次，第7周用每只10μg 3PCXZ的抗原量尾靜脈加強(qiáng).分別于免疫前（0周）及第3，5，7，9周采集血清1次.

1.2.5 細(xì)胞免疫的檢測

1.2.5.1 ELISPOT檢測T淋巴細(xì)胞分泌IFN－γ細(xì)胞因子

于免疫后第9周，取小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分離液，去除血紅細(xì)胞及細(xì)胞碎片.取分離所得的細(xì)胞100μL（2×106細(xì)胞／mL），置于96孔培養(yǎng)板（MultiScreen，Millipore），培養(yǎng)板預(yù)先以抗鼠－IFN－γ單克隆抗體包被，培養(yǎng)基為含10%的熱失活胎牛血清的RPMI1640.分別以3PCXZ、不相關(guān)蛋白BSA為刺激抗原加入各培養(yǎng)孔中，于含5%CO2的孵箱中37℃孵育40h.根據(jù)U－CyTech公司的ELISPOT試劑盒說明進(jìn)行洗板，加入檢測抗體，以及斑點顯色.通過ELISPOT專用讀板機(jī)對各孔進(jìn)行斑點計數(shù).每個斑點分別代表1個分泌IFN－γ的細(xì)胞.

1.2.5.2 細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞效應(yīng)（CTL效應(yīng)）

于免疫后第9周，取小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液，約2×107mL－1，置于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%的熱失活胎牛血清以及25U／mL IL－2的RPMI1640，加3PCXZ抗原至終濃度為10μg／mL，于5%CO2的孵箱中37℃培養(yǎng).第5天，取同品系的未免疫過的小鼠脾淋巴細(xì)胞，同3pcxz（100μg／mL）共孵育15～20min，然后經(jīng)絲裂霉素處理細(xì)胞.將此刺激細(xì)胞以1∶3的比例分別加入之前培養(yǎng)的6孔板細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)2天左右.第7天，收集刺激后的淋巴細(xì)胞，用RPMI1640洗滌2～3次，再以含5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸作為效應(yīng)細(xì)胞.取靶細(xì)胞P815細(xì)胞，分別同3PCXZ或BSA蛋白抗原，37℃孵育15～20min，然后依次用含10%FBS的PBS，RPMI1640洗滌2～3次，最后以含5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105mL－1.效應(yīng)細(xì)胞／靶細(xì)胞（E:T）按50∶1，25∶1，12.5∶1比例各50μL加入U型底的96孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，對照用100μL RPMI1640取代效應(yīng)細(xì)胞的3孔為自然釋放孔，100μL 10%Triton X－100取代效應(yīng)細(xì)胞的3孔為最大釋放孔.作用4h后，250r／min離心4min，取上清50μL測定各孔的乳酸脫氫酶的活性.

2 結(jié) 果

2.1 原核表達(dá)載體pET－28b（＋）／3pcxz構(gòu)建

將合成的多表位基因pcz同pcx基因相連構(gòu)建多表位HCV抗原基因pcxz[20]，將其裝載于表達(dá)載體pET－28b（＋）中構(gòu)建pET－28b（＋）／pcxz原核表達(dá)系統(tǒng).以pcxz基因為模板PCR擴(kuò)增帶有不同酶切位點的3段pcxz片段A，B和C，再將其依次克隆至pET－28b（＋）表達(dá)載體的多克隆位點中，構(gòu)建pET－28b（＋）／3pcxz表達(dá)系統(tǒng)，克隆步驟見圖1（a），PCR擴(kuò)增后鑒定結(jié)果見圖1（b），進(jìn)一步的測序結(jié)果也證明克隆序列完全正確（未列出）.

圖1 多表位抗原pcxz和3pcxz基因示意圖（a）和酶切驗證（b）Fig.1 Map of pcxz ＆3pcxz multiepitope gene（a）and detection of enzyme digestion（b）

2.2 多表位抗原3PCXZ的表達(dá)與純化

重組質(zhì)粒pET－28b（＋）／3pcxz轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21（DE3）菌株，1mmol／L IPTG誘導(dǎo)后得到分子質(zhì)量為50ku左右的蛋白（圖未顯示）.大量表達(dá)后，利用重組蛋白上帶有的6個His標(biāo)簽與Ni2＋親和層析柱特異結(jié)合，經(jīng)Ni2＋－NTA－agarose層析柱快速純化后，得到3PCXZ蛋白（圖2）.蛋白分子質(zhì)量在48 ku左右，與預(yù)期一致.

2.3 Western blot

Western blot結(jié)果（圖3）顯示重組表達(dá)的3PCXZ蛋白能被丙型肝炎患者血清識別，而不被正常人血清識別，表明多表位抗原3PCXZ蛋白具有丙肝病毒抗原的特異性.

2.4 多表位抗原誘導(dǎo)的特異性體液免疫應(yīng)答

重組表達(dá)的多表位抗原3PCXZ免疫BALB／c小鼠，于第2次免疫后第5周檢測到特異性IgG抗體產(chǎn)生，并且裸蛋白免疫組抗體滴度顯著高于弗氏佐劑聯(lián)合蛋白組（圖4（a））.隨著時間推移和免疫次數(shù)的增加，IgG抗體滴度在升高.IgG1和IgG2a亞型的比例是評價免疫反應(yīng)的重要指標(biāo).對3PCXZ免疫小鼠的血清中的IgG1和IgG2a抗體滴度分別進(jìn)行了檢測，結(jié)果見圖4（b）.抗原蛋白3PCXZ引起的主要是IgG1型反應(yīng)，也就是基于Th2的免疫反應(yīng).

2.5 多表位抗原誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答

2.5.1 INF－γ細(xì)胞因子分泌

于免疫后第9周取免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞，檢測特異性分泌INF－γ細(xì)胞因子的CD4＋T細(xì)胞（圖5）.以重組抗原3PCXZ體外再刺激免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞，3PCXZ＋Ad組分泌INF－γ的CD4＋T細(xì)胞數(shù)最多，每106個細(xì)胞中達(dá)到（698±229）個.統(tǒng)計學(xué)分析表明3PCXZ＋Ad組同免疫對照組PBS組相比，差異顯著（＊P＝0.023＜0.05）.以BSA體外刺激免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞，各組均未顯著分泌相應(yīng)的INF－γ.

2.5.2 細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)

于免疫后第9周分別用抗原3PCXZ、不相關(guān)蛋白BSA作為刺激物刺激免疫小鼠的脾細(xì)胞，結(jié)果誘發(fā)了較高水平的特異性CTL應(yīng)答（圖6，見第110頁）.用3PCXZ蛋白作為刺激物，最高溶解率達(dá)到40.54%（3PCXZ＋Ad組），顯著高于對照組（PBS）（圖6（a））.而以BSA作為體外刺激原，各組所產(chǎn)生的溶解率均低于10%（圖6（b））.

3 討 論

與傳統(tǒng)全基因疫苗相比，人工合成的多表位抗原基因有著無法比擬的優(yōu)點[21，22]:1）具有更廣的選擇范圍，無論是同一基因的不同區(qū)域還是不同基因甚至同一病原體不同階段，從而能提供更廣更強(qiáng)的免疫保護(hù)；2）作為一種合成疫苗更安全而且價廉又易于生產(chǎn)及儲存；3）由于表位片段都是很短的多肽，其保守性相當(dāng)較高，而且可以只針對保守區(qū)選擇免疫表位，這對一些高變異的病原體比如HCV，HIV等而言尤為重要.因此目前已成為許多疾病疫苗研究的一個重要方向，具有重要的理論意義及潛在的應(yīng)用價值.

圖6 多表位抗原3PCXZ免疫小鼠后的CTL反應(yīng)Fig.6 CTL response of mice immunized with 3PCXZ antigen against 3PCXZ recombined protein

為了使得合成的多表位抗原能有效引起B(yǎng)細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生特異的抗體，另外根據(jù)陳麗珊等[14]的研究結(jié)果，3串聯(lián)HCV多表位抗原PCX形成的多表位HCV抗原PCX3所引起的免疫反應(yīng)顯著強(qiáng)于PCX，所以，本文將pcxz串聯(lián)成3pcxz，以合成的抗原蛋白免疫BALB／c小鼠，結(jié)果顯示針對蛋白抗原的特異性IgG抗體滴度最高達(dá)到5.8×105，說明合成的多表位抗原能有效誘發(fā)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫.然而，楊桂梅等[20]以PCXZ為抗原免疫BALB／c小鼠得到約6.56×105IgG抗體滴度，本文在pcxz基礎(chǔ)上串聯(lián)表位合成的3pcxz較之前在B細(xì)胞免疫上并沒有提高.

一個理想的疫苗必須同時含有B細(xì)胞及T細(xì)胞表位，特別是針對那些在體內(nèi)主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的病原體，如HIV、HCV及流感病毒等.本文合成的多表位抗原3PCXZ不僅誘導(dǎo)所免疫的BALB／c小鼠產(chǎn)生較高滴度的IgG抗體反應(yīng)，而且能刺激CD4＋T細(xì)胞分泌INF－γ細(xì)胞因子以及產(chǎn)生特異性的細(xì)胞毒T細(xì)胞效應(yīng).3pcxz抗原免疫后，在1×106脾淋巴細(xì)胞中最多達(dá)（698±229）個分泌INF－γ的CD4＋T細(xì)胞.用佐劑一組的免疫效應(yīng)要強(qiáng)于不用佐劑的一組.而楊桂梅等[20]構(gòu)建的PCXZ抗原免疫BALB／c小鼠能夠產(chǎn)生（675±135）個CD4＋T細(xì)胞.可見pcxz和3pcxz的免疫原性并沒有多大差異，同時3pcxz抗原的CTL殺傷率與PCXZ抗原的CTL殺傷率都達(dá)40.54%，說明合成抗原3PCXZ也能有效引起細(xì)胞免疫應(yīng)答但是并沒有比PCXZ提高.究其原因可能是PCX抗原較小（10ku），而小蛋白抗原不能有效引起體液免疫應(yīng)答，而PCXZ抗原約有21ku足夠引起相應(yīng)的免疫應(yīng)答.如果再加上其串聯(lián)重復(fù)序列，也許只是單純的增加了抗原的大小，并沒有從根本上增加抗原的復(fù)雜性，那么在引起細(xì)胞免疫應(yīng)答的時候，就并不能提高和增強(qiáng)細(xì)胞的各種免疫應(yīng)答效應(yīng)，而當(dāng)序列增加到一定長度以后，由于空間構(gòu)象的變化等，抗原的免疫原性可能不會單純的因為其本身的大小而增加免疫原性，以后在設(shè)計多表位抗原的時候，應(yīng)該從增加抗原本身多肽表位的復(fù)雜性這一方面考慮.另外，本文所選用的弗氏佐劑并未顯著增強(qiáng)無論是細(xì)胞免疫還是體液免疫應(yīng)答.今后可以考慮選擇其他佐劑，比如CRL－1005聚合物和ISA－720山小星蒜堿.所以，在以后設(shè)計針對HCV的多表位抗原的時候，有必要考慮抗原結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和表位的異質(zhì)性，另外也同時可以考慮在免疫的時候，使用不同的佐劑以增加抗原的免疫原性.

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