白斑綜合征病毒感染對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺免疫酶活性及超微結(jié)構(gòu)的影響

孫 婷，劉阿靜，左 迪，吳東蕾，孔 玲，趙云龍

（華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海200062）

白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）是全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害最大的病原之一，具有很強(qiáng)的感染能力，且地域分布及宿主范圍廣泛，大多數(shù)水產(chǎn)甲殼類(lèi)動(dòng)物都是其敏感宿主［1－2］.近年來(lái)有關(guān)WSSV研究的報(bào)道主要涉及紅螯光殼螯蝦（Cherax quadricarinatus）［3］、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）［4］、日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）［5］、斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）［6］、凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）［7］等.已有研究表明 WSSV可感染多種甲殼類(lèi)動(dòng)物，除了大多數(shù)蝦類(lèi)以外，蟹類(lèi)也是其自然宿主［8－9］.中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱(chēng)河蟹，其生長(zhǎng)快，肉鮮味美，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是我國(guó)重要的名特優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一.近年來(lái)隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化程度的提高，在江浙地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也相繼出現(xiàn)了白斑綜合征疾病，給河蟹養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了一定的影響［10］.因此了解WSSV的致病機(jī)理，尋找預(yù)防控制該疾病的有效途徑的問(wèn)題亟待解決.

針對(duì)甲殼類(lèi)動(dòng)物不具有特異性免疫系統(tǒng)的生理特點(diǎn)，可采用免疫增強(qiáng)劑來(lái)啟動(dòng)和調(diào)節(jié)其非特異性免疫，提高免疫能力［11］，并業(yè)已證明免疫多糖（酵母細(xì)胞壁）對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有非特異性免疫刺激活性［12］，如中國(guó)對(duì)蝦（Penaeus chinensis）、南美白對(duì)蝦（Penaeus vannawei）等甲殼類(lèi)注射或服用含多糖等成分的免疫增強(qiáng)劑后，可激活其免疫系統(tǒng)，提高抗病力，降低死亡率［13－14］.

甲殼動(dòng)物體液中一般不具有免疫球蛋白，無(wú)抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，免疫相關(guān)酶在體液免疫中起到重要作用［15］.超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）都是機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶，可有效清除超氧自由基，防止機(jī)體出現(xiàn)生物分子損傷，過(guò)量的超氧自由基能導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，因此SOD和POD活性能反應(yīng)機(jī)體的免疫防御能力［16］.酸性磷酸酶（acid phosphate，ACP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphate，AKP）是機(jī)體內(nèi)重要的代謝調(diào)控酶，催化磷酸單酯的水解反應(yīng)和磷酸基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，加速物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，與核酸、蛋白質(zhì)、脂肪及磷酸的代謝密切相關(guān)［17］.酚氧化酶（phenoloxidase，PO）通過(guò)酚氧化酶原系統(tǒng)的激活作用而產(chǎn)生，可將酚催化形成黑色素，在傷口愈合、抑制甚至殺死病原體方面發(fā)揮重要作用，是甲殼動(dòng)物抗病力的免疫指標(biāo)之一［18］.這些酶活力的高低會(huì)由于機(jī)體受到異物或病原的感染而變化，也會(huì)因免疫多糖類(lèi)物質(zhì)的刺激而有所提高，從而表明機(jī)體的免疫狀態(tài).肝胰腺組織作為甲殼動(dòng)物的重要組成部分，具有消化、吸收、代謝等多種功能，同時(shí)易受到病毒、細(xì)菌、重金屬等有害物質(zhì)的影響.因此本文通過(guò)人工注射WSSV和免疫多糖，研究其對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺免疫相關(guān)酶活性及超微結(jié)構(gòu)的影響，探討WSSV對(duì)該蟹的免疫毒性作用及免疫多糖對(duì)其免疫防御系統(tǒng)的影響，以期為中華絨螯蟹的健康養(yǎng)殖和該疾病的有效防治提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用中華絨螯蟹采自上海市金山區(qū)漕涇特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，平均體重為（33.042±5.262）g.挑選健全的個(gè)體于已消毒的水族箱中暫養(yǎng)10d.每日定時(shí)投喂餌料2次，并在投餌前吸凈殘餌及糞便，更換約為1／3的養(yǎng)殖用水.自然光照，連續(xù)充氣，溶解氧為（6.2±0.5）mg／L，水溫為（23±1）℃.

WSSV病毒由浙江省淡水水產(chǎn)研究所魚(yú)類(lèi)免疫與健康重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)（病樣來(lái)源于江蘇某紅螯光殼螯蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，由該實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存）.將感染后病蝦的血淋巴、鰓等組織與無(wú)菌生理鹽水按1∶10（w∶V）比例混勻稀釋?zhuān)M織勻漿器勻漿，6 000r／min離心5min及10 000r／min離心10min，上清經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝成病毒保存液，于－80℃凍存?zhèn)溆?

免疫多糖（酵母細(xì)胞壁）購(gòu)于湖北安琪酵母公司，該產(chǎn)品主要含有β－葡聚糖（≥29%），α－甘露聚糖肽（≥20%），肽類(lèi)及蛋白質(zhì)（≥30%），幾丁質(zhì)（≥2%），用生理鹽水配制成濃度為1.0%的免疫多糖溶液，高壓滅菌后備用.正式實(shí)驗(yàn)前用不同濃度（0.0%，1.0%，2.0%）的免疫多糖（0.1mL／尾）注射中華絨螯蟹，72h后取蟹肝胰腺、鰓、肌肉、血淋巴，測(cè)定SOD、POD、ACP、AKP、PO活性，結(jié)果顯示注射1.0%免疫多糖時(shí)，4種組織中5種免疫酶活性均顯著升高.因此采用1.0%免疫多糖對(duì)中華絨螯蟹進(jìn)行注射效果最佳.

1.2 人工感染實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)處理組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行20尾實(shí)驗(yàn)用蟹.取已制備的病毒保存液，人工感染健康中華絨螯蟹以復(fù)壯病毒，0.1～0.2mL／尾，攻毒后3～5d采集各發(fā)病蟹的血淋巴反復(fù)凍融，4 000r／min離心5min，提取上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

實(shí)驗(yàn)組Ⅰ于蟹第4步足基部肌肉處注射WSSV病毒液0.1mL／尾；實(shí)驗(yàn)組Ⅱ注射1.0%免疫多糖溶液0.1mL／尾；實(shí)驗(yàn)組Ⅲ先注射1.0%免疫多糖溶液0.1mL／尾，48h后再注射病毒液0.1mL／尾；對(duì)照組注射PBS緩沖液（pH 7.4）0.1mL／尾.實(shí)驗(yàn)期間的飼養(yǎng)管理與暫養(yǎng)期相同.

1.3 樣品采集與處理

分別于感染后0h，6h，12h，24h，48h，72h，96h，5d，6d，從各處理組中取3尾實(shí)驗(yàn)用蟹，經(jīng)滅菌生理鹽水潤(rùn)洗后冰凍麻醉，迅速解剖取其肝胰腺，液氮速凍帶回實(shí)驗(yàn)室，置于－80℃冰箱中備用.樣品測(cè)定前將冷凍樣品1g冰浴融化，按1∶9（質(zhì)量體積比）加入預(yù)冷滅菌的生理鹽水冰浴勻漿，制備成10%的組織勻漿液.3 500r／min，4℃低溫離心10min，除去上層脂肪和底部沉淀即為肝胰腺提取液，用于蛋白質(zhì)含量及SOD、POD、ACP、AKP、PO活性的測(cè)定.

1.4 免疫酶活性的測(cè)定

肝胰腺組織液中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮蘭蛋白試劑盒測(cè)定.SOD活性測(cè)定采用超氧化物歧化酶試劑盒（黃嘌呤氧化酶法），每毫克組織蛋白在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位（U）.POD活性測(cè)定采用過(guò)氧化物酶測(cè)定試劑盒，在37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg的底物酶量定義為1個(gè)酶活力單位.ACP與AKP活性的測(cè)定分別采用酸性磷酸酶和堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒，其中ACP是以每克組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用30min產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)活力單位；AKP是以每克組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用15min產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)活力單位.PO活性測(cè)定以0.01mol／L的L－dopa（上海伯奧生物科技公司，GB1009）為特異性底物，將100μL肝胰腺組織液及100μL 0.01mol／L的L－dopa于28℃恒溫水浴中混勻，40min后加入3mL預(yù)冷的磷酸鉀鹽緩沖液（0.1mol／L，pH 6.0），此反應(yīng)條件下，以 OD490每分鐘增加0.001定義為1個(gè)酶活力單位［19］.免疫酶活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所.

1.5 透射電鏡實(shí)驗(yàn)

分別取72h對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的中華絨螯蟹肝胰腺，切割成1mm3組織塊，立即置于2.5%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛中固定，用PBS緩沖液漂洗后，再經(jīng)2.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）鋨酸固定，梯度濃度酒精脫水，丙酮轉(zhuǎn)換，Epon812包埋，LKB超薄切片機(jī)切片，厚度70nm，醋酸雙氧鈾－檸檬酸鉛雙染法染色，Hitachi－7650型透射電鏡觀察拍照.

1.6 數(shù)據(jù)分析

所測(cè)數(shù)據(jù)以SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用One－Way ANOVA法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn).

2 結(jié) 果

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Ⅱ的中華絨螯蟹在實(shí)驗(yàn)時(shí)間6d內(nèi)全部存活，實(shí)驗(yàn)組Ⅲ中華絨螯蟹存活率下降為56.31%，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ存活率僅為6.26%.感染W(wǎng)SSV的病蟹出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、行動(dòng)緩慢、步足無(wú)力、食欲減退等癥狀，解剖后發(fā)現(xiàn)肝胰腺呈淡黃色甚至灰白色，鰓排列無(wú)序，呈淺棕色，血淋巴稀薄，凝固緩慢或不凝固.

2.1 WSSV及免疫多糖對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺SOD活性的影響

實(shí)驗(yàn)組Ⅰ和ⅢSOD活性均呈下降趨勢(shì)，且48h～6d顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組Ⅲ酶活性高于實(shí)驗(yàn)組Ⅰ；實(shí)驗(yàn)組ⅡSOD活性呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，24h達(dá)到最高值，且極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）（圖1）.

圖1 WSSV及免疫多糖對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺SOD活性的影響Fig.1 Effects of WSSV and immune polysaccharide on SOD activities in the hepatopancreas of E.sinensis

2.2 WSSV及免疫多糖對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺POD活性的影響

實(shí)驗(yàn)組ⅠPOD活性呈降低趨勢(shì)，且24h～6d顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組ⅡPOD活性先升高后降低，24h上升到最高值，且24h～6d極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組ⅢPOD活性也呈先升后降的趨勢(shì)，除6h以外，均與對(duì)照組形成顯著差異（P＜0.05），酶活性高于實(shí)驗(yàn)組Ⅰ（圖2）.

2.3 WSSV及免疫多糖對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺ACP活性的影響

實(shí)驗(yàn)組ⅠACP活性呈先減弱后增強(qiáng)再減弱的趨勢(shì)，且極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組Ⅱ呈先升后降的趨勢(shì)，12～48h極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組Ⅲ酶活性先升后降，在48h注射WSSV后極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），酶活性始終高于實(shí)驗(yàn)組Ⅰ（圖3）.

2.4 WSSV及免疫多糖對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺AKP活性的影響

實(shí)驗(yàn)組ⅠAKP活性呈先降后升再降的趨勢(shì)，酶活性均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組Ⅱ酶活性先升后降，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組ⅢAKP活性先升后降，6～48h高于對(duì)照組，72h～6d感染W(wǎng)SSV后極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），但高于實(shí)驗(yàn)組Ⅰ（圖4）.

2.5 WSSV及免疫多糖對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺PO活性的影響

實(shí)驗(yàn)組ⅠPO活性呈先升后降趨勢(shì)，24h～6d均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組ⅡPO活性先升后降，在72h達(dá)到最高值，48h～6d極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組ⅢPO活性整體也呈現(xiàn)先升后降又升高的趨勢(shì)（圖5，見(jiàn)第750頁(yè)）.

2.6 WSSV及免疫多糖對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響

圖5 WSSV及免疫多糖對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺PO活性的影響Fig.5 Effects of WSSV and immune polysaccharide on PO activities in the hepatopancreas of E.Sinensis

對(duì)照組中華絨螯蟹肝小管上皮細(xì)胞，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體結(jié)構(gòu)清晰完整（圖版1，見(jiàn)第750～751頁(yè)）；微絨毛排列整齊（圖版2）；線粒體較豐富，其外層膜平滑完整，內(nèi)層膜折疊成的嵴排列緊密，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈扁平囊狀（圖版3）.

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ肝胰腺超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊膜出現(xiàn)斷裂，線粒體變形損傷（圖版4）；微絨毛凌亂無(wú)序（圖版5）；線粒體變形呈不規(guī)則狀，內(nèi)嵴減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂為片狀，分布雜亂（圖版6）.

實(shí)驗(yàn)組Ⅱ肝小管上皮細(xì)胞，線粒體結(jié)構(gòu)完整（圖版7）；微絨毛排列整齊（圖版8）；線粒體呈橢圓形，內(nèi)嵴明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰完整（圖版9）.

實(shí)驗(yàn)組Ⅲ肝小管上皮細(xì)胞，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂成片狀，排列凌亂，線粒體畸變（圖版10）；微絨毛排列不整齊（圖版11）；部分線粒體內(nèi)嵴消失，出現(xiàn)空泡化（圖版12）.

圖版WSSV對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響Plate Impact of WSSV on the ultrastructure of hepatopancreas in E.Sinensis

3 討 論

3.1 WSSV及免疫多糖對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺免疫酶活性的影響

SOD是生物體內(nèi)最為重要的抗氧化酶之一，具有消除氧自由基的功效，從而阻止氧自由基對(duì)細(xì)胞和膜系統(tǒng)的損傷［20］.本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組ⅠSOD活性呈下降趨勢(shì)，這與WSSV感染斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺SOD活性變化一致［21］.但感染初期6～24h，SOD活性下降幅度不大，與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），48h～6d酶活性顯著降低（P＜0.05），這一變化反映了感染病毒后自由基在生物體內(nèi)累積的過(guò)程.隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，WSSV在體內(nèi)不斷增殖，WSSV刺激機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的自由基已無(wú)法通過(guò)機(jī)體的應(yīng)激性消除，導(dǎo)致自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)加速，細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，膜功能出現(xiàn)障礙，致使抗氧化防御系統(tǒng)功能下降，最終SOD活性降低.

POD廣泛存在于真核生物體內(nèi)，在清除自由基，防止生物分子損傷方面有重要作用，根據(jù)POD活性可推斷生物體的生理狀態(tài)［22］.實(shí)驗(yàn)組Ⅰ人工感染 WSSV 24h后POD活性開(kāi)始顯著降低（P＜0.05），由于WSSV的入侵和增殖，免疫防御機(jī)能受損，細(xì)胞平衡遭到破壞，致使POD活性降低.

ACP是巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體的標(biāo)志酶，是溶酶體的重要組成部分，與吞噬作用密切相關(guān)，在破壞和消滅胞外入侵者中發(fā)揮重要作用［4］.AKP是一種磷酸單酯酶，可催化所有的磷酸單脂的水解反應(yīng)及磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，對(duì)生物體的代謝調(diào)控起重要作用［23］.ACP和AKP是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，形成水解酶體系，破壞消除侵入體內(nèi)的異物［15］.已有研究表明，甲殼動(dòng)物血細(xì)胞的吞噬和包囊免疫反應(yīng)伴隨有ACP和AKP的釋放，通過(guò)水解作用將表面帶有磷酸酯的異物破壞或降解［24］.實(shí)驗(yàn)組Ⅰ中ACP和AKP活性都呈先減弱后增強(qiáng)再減弱的趨勢(shì)，這與WSSV感染日本囊對(duì)蝦仔蝦ACP及AKP活性變化一致［5］.由于磷酸酶主要位于膜系統(tǒng)上，感染初期的膜比較完整穩(wěn)定，病毒不易入侵，磷酸酶活性微弱或無(wú)活性；感染中期，在病毒強(qiáng)烈刺激下，機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)磷酸酶的合成，活性增強(qiáng).在感染后期，由于病毒在細(xì)胞內(nèi)的大量增殖，嚴(yán)重?fù)p傷了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，酶活受到抑制.

PO是一種氧化還原酶，在甲殼動(dòng)物體內(nèi)以酚氧化酶原形式存在，酚氧化酶原激活系統(tǒng)是甲殼動(dòng)物的識(shí)別和防御系統(tǒng)，可被病原體激活生成活性物質(zhì)，從而發(fā)揮免疫功能，抵抗有害物質(zhì)［25－26］.實(shí)驗(yàn)組Ⅰ感染W(wǎng)SSV 12h后，酚氧化酶原被WSSV激活，轉(zhuǎn)變成活性的PO，因此酶活性升高；24h后PO活性開(kāi)始下降，這是由于病毒的擴(kuò)繁，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，從而抑制PO活性.

實(shí)驗(yàn)組Ⅱ（注射免疫多糖組）5種酶活性均呈現(xiàn)先上升后降低的變化趨勢(shì)，分別于24h、48h、72h達(dá)到峰值，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中POD、AKP、PO酶活性一直維持較高水平，一直到6d酶活性仍與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05），表明人工注射1.0%免疫多糖至少在24h～6d內(nèi)能夠提高中華絨螯蟹免疫酶活性，增強(qiáng)抗病毒能力.酵母細(xì)胞壁免疫多糖中主要的功能成分是β－（1，3）、β－（1，6）葡聚糖和甘露聚糖，能夠?qū)?xì)菌、真菌和病毒引起的疾病產(chǎn)生非特異性免疫力，其中β－葡聚糖是最有效的免疫刺激劑，其獨(dú)特的螺旋形分子結(jié)構(gòu)，很容易被動(dòng)物機(jī)體血細(xì)胞或巨噬細(xì)胞上的受體所識(shí)別，從而能有效引發(fā)機(jī)體相應(yīng)的免疫功能［27］.一般情況下，巨噬細(xì)胞不具有活性，當(dāng)β－葡聚糖通過(guò)細(xì)胞表面糖蛋白（Lectin）與巨噬細(xì)胞結(jié)合后，巨噬細(xì)胞被激活，并能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)［28］.從以上5種免疫酶活性的變化可以看出，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ與對(duì)照組相比酶活性顯著增加，24～72h酶活性達(dá)到最大值，并且實(shí)驗(yàn)組Ⅲ48h注射WSSV后酶活性高于實(shí)驗(yàn)組Ⅰ，說(shuō)明人工注射免疫多糖能夠提高中華絨螯蟹5種免疫相關(guān)酶的活性，增強(qiáng)其抵抗病毒的能力，對(duì)于改善中華絨螯蟹的非特異性免疫功能，減少病害發(fā)生，提高成活率有重要作用.這與酵母細(xì)胞壁在其他甲殼動(dòng)物的研究結(jié)果一致，如許第新等以酵母細(xì)胞壁作為免疫激活劑注射克氏原螯蝦后發(fā)現(xiàn)肝胰腺中的ACP和AKP活性明顯增強(qiáng)［29］.陳昌福的研究也表明在南美白對(duì)蝦飼料中添加酵母細(xì)胞壁多糖可極顯著提高肝胰腺中POD、ACP和AKP活性，增強(qiáng)抗菌能力［30］.王芳用酵母細(xì)胞壁多糖浸浴羅氏沼蝦后，肝胰腺中的ACP、POD、SOD活性均呈上升趨勢(shì)［31］.說(shuō)明酵母細(xì)胞壁多糖具有提高動(dòng)物自身免疫力的作用，而且酵母細(xì)胞壁多糖在水產(chǎn)動(dòng)物中的應(yīng)用低毒、無(wú)殘留，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展具有十分重大的意義.

3.2 WSSV及免疫多糖對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響

十足目的肝胰腺為成對(duì)的葉狀器官，由大量絲狀的盲管即肝小管組成，每一肝小管均由位于基膜上的單層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成［32］.肝胰腺是甲殼動(dòng)物新陳代謝的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是病毒、細(xì)菌及其他有害物質(zhì)的主要積累場(chǎng)所.感染W(wǎng)SSV的實(shí)驗(yàn)組Ⅰ肝胰腺上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重?fù)p傷，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊膜斷裂受損嚴(yán)重，影響酶和其他蛋白質(zhì)的合成及貯存.微絨毛具有增加肝小管吸收和分泌面積的作用［33］，微絨毛受損將會(huì)降低肝胰腺對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和分泌.作為新陳代謝最旺盛的器官，肝胰腺細(xì)胞中含有較豐富的線粒體，其內(nèi)外雙層膜和內(nèi)嵴在電子傳遞和能量合成中起著重要作用［34］.線粒體內(nèi)嵴減少或消失，出現(xiàn)膜性退化，必然抑制細(xì)胞內(nèi)的能量代謝活動(dòng).肝胰腺細(xì)胞內(nèi)部基本結(jié)構(gòu)的損傷必然導(dǎo)致肝胰腺整體生理功能的紊亂或喪失，進(jìn)而影響整個(gè)生物體的代謝活動(dòng)，使中華絨螯蟹的免疫力和抗逆性下降，最終導(dǎo)致死亡.實(shí)驗(yàn)組Ⅱ細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰完整，實(shí)驗(yàn)組Ⅲ肝胰腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)雖有一定程度的損傷，但相對(duì)實(shí)驗(yàn)組Ⅰ而言細(xì)胞核形狀規(guī)則，細(xì)胞器損傷程度較輕.因此，結(jié)合酶學(xué)結(jié)果，進(jìn)一步說(shuō)明了人工注射免疫多糖能夠增強(qiáng)中華絨螯蟹的免疫機(jī)能，提高其抗病力，對(duì)WSSV的侵染有一定的抵御作用.

［1］閆春冬.對(duì)蝦白斑征病毒（WSSV）宿主研究進(jìn)展［J］.海洋湖沼通報(bào)，2007，1：136－140.

［2］Wang Y C，Lo C F，Chang P S，et al.Experimental infection of white spot baculovirus in some cultured and wild decapods in Tai wan［J］.Aquaculture，1998，164：221－231.

［3］Wang D L，Zuo D，Wang L M，et al.Effects of white spot syndrome virus infection on immuno－enzyme activities and ultrastructure in gills of Cherax quadricarinatus［J］.Fish ＆Shellfish Immunology，2012，32（5）：645－650.

［4］李海兵，宋曉玲，韋 嵩，等.WSSV對(duì)克氏原螯蝦血細(xì)胞吞噬和肝胰腺磷酸酶活性的影響［J］.漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2011，32（2）：78－82.

［5］張 曼，宋維彥，王 軍.白斑綜合征病毒對(duì)日本囊對(duì)蝦仔蝦免疫相關(guān)酶活性的影響［J］.廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，50（1）：118－122.

［6］Rameshthangam P，Ramasamy P.Antioxidant and membrane bound enzymes activity in WSSV－infected Penaeus monodon Fabricius［J］.Aquaculture，2006，254：32－39.

［7］Lotz J M，Soto M A.Model of white spot syndrome virus（WSSV）epidemics in Litopenaeus vanamei［J］.Diseases of Aquatic Organisms，2002，50（3）：199－209.

［8］Zhan W B，Zhang L F，Wang Y H，et al.White spot syndrome virus infection to crabs［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，39（增刊）：154－158.

［9］李貴生，何建國(guó).蝦蟹混養(yǎng)與病毒病的傳播［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，22（3）：101－104.

［10］薛 暉，丁正峰，周 剛，等.白斑綜合征病毒（WSSV）在幾種經(jīng)濟(jì)類(lèi)甲殼動(dòng)物中的感染與流行調(diào)查研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（3）：294－296.

［11］沈錦玉，劉 問(wèn)，曹 錚，等.免疫增強(qiáng)劑對(duì)中華絨螯蟹免疫功能的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，16（1）：25－29.

［12］陳超然，陳 萱，陳昌福，等.酵母β－葡聚糖對(duì)受免異育銀鯽免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22（4）：380－384.

［13］劉樹(shù)青，江曉路，牟海津，等.免疫多糖對(duì)中國(guó)對(duì)蝦血清溶菌酶、磷酸酶和過(guò)氧化物酶的作用［J］.海洋與湖沼，1999，30（3）：279－283.

［14］陳昌福，姚 娟，陳 萱，等.免疫多糖對(duì)南美白對(duì)蝦免疫相關(guān)酶的激活作用［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23（5）：551－554.

［15］管曉娟.甲殼動(dòng)物體液免疫相關(guān)酶及免疫因子研究概況［J］.生命科學(xué)儀器，2009，7（6）：3－7.

［16］黃旭雄，周洪琪.甲殼動(dòng)物免疫機(jī)能的衡量指標(biāo)及科學(xué)評(píng)價(jià)［J］.海洋科學(xué)，2007，31（7）：90－96.

［17］魏克強(qiáng)，許梓榮.對(duì)蝦的免疫機(jī)制及其疾病預(yù)防策略的研究［J］.中國(guó)獸藥雜志，2004，38（9）：25－29.

［18］徐海圣，徐步進(jìn).甲殼動(dòng)物細(xì)胞及體液免疫機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，16（1）：49－56.

［19］Ashida M.Purification and characterization of prephenoloxidate from hemolymph of the silkwormBombyx mori［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1971，144（2）：749－762.

［20］牟海津，江曉路，劉樹(shù)青，等.免疫多糖對(duì)櫛孔扇貝酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影響［J］.青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，29（3）：463－468.

［21］Mathew S，Kumar K A，Anandan R，et al.Changes in tissue defence system in white spot syndrome virus（WSSV）infected Penaeus monodon［J］.Comparative Biochemistry and Physiology，Part C，2007，145：315－320.

［22］楊玉姣，王國(guó)良，金 珊，等.環(huán)境脅迫對(duì)對(duì)蝦免疫系統(tǒng)的影響研究［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2006，25（12）：652－65.

［23］樊甄姣，劉志鴻，楊?lèi)?ài)國(guó)，等.Vc對(duì)櫛孔扇貝體內(nèi)水解酶和抗氧化酶活性的影響［J］.海洋水產(chǎn)研究，2006，27（4）：12－16.

［24］Kawakami H，Shinohara N，Sakai M.The non－specific immuno－stimulation and adjuvant effects of Vibrio anguillarumbacterin，M－glucan，chitin and Freund's complete adjuvant against Pasteurella piscicida infection in yellowtail［J］.Fish Pathology，1998，33（3）：283－292.

［25］Ratcliffe N A.Invertebrate immunity－aprimer for the non－specialist［J］.Immunology Letters，1985，10：253－270.

［26］劉雪蘭，余為一.甲殼動(dòng)物免疫因子的研究進(jìn)展［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2003，27（4）：418－421.

［27］劉立鶴，胡奇?zhèn)?，?lè)義詳，等.酵母細(xì)胞壁免疫多糖在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中的研究與應(yīng)用總結(jié)［J］.飼料與畜牧，2008（12）：54－58.

［28］張國(guó)輝，高紅梅.酵母細(xì)胞壁及其在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J］.南方水產(chǎn)，2005，1（4）：73－76.

［29］許第新，姚 娟，陳昌福.注射免疫多糖（酵母細(xì)胞壁）對(duì)克氏原螯蝦幾種免疫相關(guān)酶活性的影響［J］.淡水漁業(yè)，2004，34（5）：56－58.

［30］陳昌福，姚 娟，陳 萱，等.口服免疫多糖（酵母細(xì)胞壁）對(duì)南美白對(duì)蝦抗哈維弧菌感染的作用［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，31（4）：402－405.

［31］王 芳.酵母細(xì)胞壁多糖對(duì)羅氏沼蝦免疫相關(guān)同工酶的影響［D］.上海：上海師范大學(xué)，2011.

［32］于豐軍.鉛和鎘兩種重金屬對(duì)中華絨螯蟹的毒性效應(yīng)研究［D］.上海：華東師范大學(xué)，2005.

［33］李太武.三疣梭子蟹肝臟的結(jié)構(gòu)研究［J］.海洋與湖沼，1996，27（5）：471－475.

［34］金芬芬，王 蘭.鎘對(duì)河南華溪蟹肝胰腺線粒體自由基代謝的影響［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（2）：458－464.