LED光照對擬南芥葉綠素含量和根生長發(fā)育的影響

劉 穎，林 娟，周小麗，劉木清

（1.復(fù)旦大學(xué) 電光源研究所，先進(jìn)照明技術(shù)教育部工程研究中心，上海，200433；2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點實驗室，生命科學(xué)學(xué)院，上海，200433）

傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)依靠太陽光來促進(jìn)植物生長，會受到很多的因素，包括氣候、日照、土壤條件、溫度等的影響.隨著人口的增長，我們需要用有限的土地種植足夠多的食物來滿足現(xiàn)實的要求.設(shè)施農(nóng)業(yè)的出現(xiàn)使植物栽培的集約化、商品化成為可能［1］.現(xiàn)今最高水平的設(shè)施農(nóng)業(yè)是繼溫室栽培之后的植物工廠.植物工廠將植物的生長環(huán)境與外界隔離，能夠有效地降低氣候和環(huán)境災(zāi)害對植物生長的影響，并且提高了土地的利用率.植物工廠作為一種三贏的新型栽培技術(shù)，是未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的主流.LED（Light－Emitting Diode，發(fā)光二極管）作為新一代的節(jié)能高效新型光源的出現(xiàn)，具有優(yōu)于傳統(tǒng)植物照明光源所不具有的優(yōu)勢，為植物工廠的照明環(huán)境的設(shè)計提供了更多的可能［2－3］.

在光照對植物生長的影響方面，有不少學(xué)者做過許多工作.Bula等將萵苣在LED和藍(lán)色熒光燈（波段在400～500nm）的混合光源下培養(yǎng)21d后，與在冷白光熒光燈和白熾燈混合光源下培養(yǎng)情況相比較，發(fā)現(xiàn)兩者生長情況相當(dāng)，但用LED和藍(lán)色熒光燈光源能夠?qū)⒛芰肯臏p少一半［4］.Goins等研究了小麥在紅光LED照射下與在紅光混合10%藍(lán)光照射下的生長情況，發(fā)現(xiàn)小麥能夠在紅光照射下完成其生長周期，而且在紅藍(lán)混合光照射下的小麥能夠長得更大且孕育更多種子［5］.由于藍(lán)光LED出現(xiàn)較晚，早期使用藍(lán)色熒光燈作為藍(lán)光光源.隨著藍(lán)光LED的出現(xiàn)，人們逐漸用藍(lán)光LED光源來代替藍(lán)光熒光燈，能夠更好地控制藍(lán)光波段的光波長.Matsuda等通過實驗發(fā)現(xiàn)水稻在660nm紅光和470nm藍(lán)光下生長時，其葉片光合速率高于僅用紅光進(jìn)行補(bǔ)光照明的情況［6］.徐凱使用不同的薄膜來設(shè)置草莓生長的光環(huán)境，研究草莓在不同光照條件下的生長情況［7］.聞婧等將萵苣幼苗長成二葉一心時定植于不同的紅藍(lán)光比例的光照環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)萵苣的葉綠素含量會隨著紅藍(lán)光比值的下降而下降［8］.鐵皮石斛組織培養(yǎng)苗在LED照明光環(huán)境下培養(yǎng)90d后其葉綠素含量隨著紅藍(lán)光之比的增加而先升高再降低［9］.Nhut等人將草莓放置于紅藍(lán)光質(zhì)比分別為1∶0，9∶1，8∶2，7∶3且光量子通量密度為45μmol·m－2·s－1的光環(huán)境下培養(yǎng)30d，并將實驗重復(fù)3次后發(fā)現(xiàn)，在45μmol·m－2·s－1的光照下，葉綠素的含量是隨著紅藍(lán)光質(zhì)比增高而下降的［10］.以上研究均表明葉綠素的含量會受到不同的光照條件的影響.不同的光波段對植物的生長狀況的影響是不同的，植物生長的不同階段對光照的需求也是不一樣的.他們均是在植物長成幼苗以后再進(jìn)行光照實驗，但光照對植物的影響也有可能因為其生長階段的不同而不同.因此本文將擬南芥從萌發(fā)階段就放置在預(yù)先設(shè)計好的光環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，從紅藍(lán)光強(qiáng)度，紅藍(lán)光比例角度進(jìn)行了縱向的比較，并在相同的光量子通量密度下，與熒光燈光照環(huán)境下擬南芥的生長進(jìn)行了橫向的比較，研究了光照對擬南芥從萌發(fā)后到初步長成6～8片葉子期間的影響.

1 材料及方法

1.1 擬南芥培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)材料：擬南芥Col 0野生型；MS培養(yǎng)基：MS粉（Sigma）4.41g·L－1，蔗糖（上海強(qiáng)順）30g·L－1，瓊脂8g·L－1，milliQ水（Millipore）1L.

擬南芥的培養(yǎng)：取適量新鮮擬南芥種子，依次經(jīng)75%乙醇處理30s，無菌水清洗2～3次，18%次氯酸鈉處理8min，無菌水清洗2～3次，無菌吸水紙吸干，置于預(yù)先配置好MS培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿上.

1.2 光環(huán)境設(shè)計

基于葉綠素a、b的吸收譜，我們選擇了兩種分別位于紅藍(lán)光波段的LED光源.藍(lán)光LED光源主波長位于454nm，其色純度為98.6%；紅光LED光源主波長位于638nm，其色純度為100%.將色溫為6 212K的熒光燈作為實驗的對照組.為了能更好地調(diào)控LED燈具光照強(qiáng)度，開發(fā)了一套基于RS485協(xié)議的LED照明控制系統(tǒng).通過這套系統(tǒng)，LED光照的強(qiáng)度可以通過計算機(jī)實現(xiàn)0%～100%連續(xù)調(diào)節(jié)，其調(diào)光等級與輸出功率之間的關(guān)系如圖1（見第764頁）所示.實驗設(shè)置3個22℃恒溫箱，編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅱ.在實驗箱Ⅰ、Ⅱ中分別安裝兩個功率線性可調(diào)的LED照明系統(tǒng)，實驗箱Ⅲ中均勻安裝4個恒定功率為8W的熒光燈.實驗箱Ⅲ中熒光燈全功率輸出，其平均光量子通量密度（PPFD：Photosynthetic Photon Flux Density，單位為μmol·m－2·s－1）為64μmol·m－2·s－1左右，將LED光照箱Ⅰ的調(diào)光等級設(shè)置為紅光50%、藍(lán)光10%，LED光照箱Ⅱ的調(diào)光等級設(shè)置為紅光10%、藍(lán)光4%.采用KIPP＆ZONEN PAR光量子通量密度探頭和METEON記錄儀對實驗環(huán)境的光量子通量密度進(jìn)行測量.3個培養(yǎng)箱采用同一時間控制器，每天的光照時長為16h.一共調(diào)配27個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)箱中放置9個.表1為中數(shù)據(jù)為培養(yǎng)皿所在位置的光量子通量密度值，其中“總強(qiáng)度”表示在實驗環(huán)境按照上述設(shè)置時，所測的光量子通量密度；B列為只開啟藍(lán)光LED光源時的光量子通量密度，R列為只開啟紅光LED光源時的光量子通量密度.培養(yǎng)皿編號的上標(biāo)1）、2）、3）表示該編號的培養(yǎng)皿是放置在相應(yīng)實驗箱Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中.

表1 培養(yǎng)皿分組及其相應(yīng)光環(huán)境Tab.1 Petri dish grouping and corresponding light condition

1.3 葉綠素含量測定方法

根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收特性、郎伯－比爾定律和相應(yīng)公式可以計算出提取液中各色素的含量.實驗中采用丙酮提取法.將擬南芥的葉子取下并記錄其鮮重.將葉片浸泡于濃度為80%的丙酮溶液中遮光放置48h.使用SPECTRA MAX M5分別測試不同樣品在663nm和645nm光照下的吸光度A663，A645.然后根據(jù)以下公式計算出相應(yīng)溶液中葉綠素濃度 Ca，Cb，Ca＋b，單位為 mg·L－1.

圖1 LED燈調(diào)光等級與功率之間關(guān)系Fig.1 The relationship between dimming level and power consumption of blue and red LED light sources（N 為功率，η調(diào)光為調(diào)光等級，%.）

相應(yīng)葉綠素a，b，a＋b含量可通過將公式（1）中所計算出的葉綠素濃度帶入以下公式（2）求得，單位為 mg·g－1.

其中，ρ為葉綠素含量（mg·g－1）；C為丙酮提取液中相應(yīng)葉綠素的濃度（mg·L－1）；V 為溶液體積（mL）；A為取樣鮮重（g）.

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 光照對葉綠素含量的影響

將培養(yǎng)皿按照設(shè)計放置在培養(yǎng)箱培養(yǎng)25d后，取其葉片，采用丙酮提取方法測量葉綠素含量.結(jié)果表明在PPFD為64μmol·m－2·s－1左右的時候，熒光燈和LED燈下樣品的葉綠素a＋b平均含量分別為1.45mg·g－1和1.52mg·g－1，兩者相差0.07mg·g－1.

我們將葉綠素含量與紅藍(lán)光質(zhì)比（即紅光與藍(lán)光PPFD之比，用R／B表示）、紅光PPFD、藍(lán)光PPFD之間的關(guān)系用圖2～圖5表示，其中Chla，Chlb，Chla＋b表示與葉綠素a、b、c相對應(yīng)的曲線.從圖2可以看出，當(dāng)PPFD在64μmol·m－2·s－1左右時，葉綠素的含量隨著紅藍(lán)光比值的增高而線性降低.即在此光量子通量密度下，454nm的藍(lán)光對葉綠素的形成的促進(jìn)作用要優(yōu)于638nm的紅光.圖3中是當(dāng)光量子通量密度和紅藍(lán)光質(zhì)比均發(fā)生變化的時候，葉綠素含量隨著R／B值變化的情況.對圖3中數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，擬合相關(guān)系數(shù)R2較小.分別與Chla，Chlb，Chla＋b對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)R2為0.170 9，0.289 9和0.235 6.這說明，葉綠素含量是與紅藍(lán)光質(zhì)比以及紅藍(lán)光強(qiáng)度三者相關(guān)的物理量.它的整體趨勢隨著R／B的降低而降低的，從圖2～圖3中可以看出，在454nm和638nm的光環(huán)境下，藍(lán)光對實驗中樣品的葉綠素的影響是高于紅光.將葉綠素含量與藍(lán)光PPFD的關(guān)系繪制成圖4，直接將Chla，Chlb，Chla＋b擬合成6次多項式后的曲線與原數(shù)據(jù)點的相關(guān)性可以分別達(dá)到0.945 1，0.717 9和0.908 8.使用同樣方法將葉綠素含量與635nm的紅光的數(shù)據(jù)點進(jìn)行擬合，只能得到相關(guān)度為0.437 2，0.675 4和0.560 8的曲線，如圖5所示.在圖4中標(biāo)記出Chla＋b數(shù)據(jù)點的紅光PPFD值（原點旁邊的數(shù)字即為相應(yīng)點處的紅光PPFD值）.將該標(biāo)記值與藍(lán)光PPFD值結(jié)合比較，發(fā)現(xiàn)當(dāng)454nm的藍(lán)光PPFD小于30μmol·m－2·s－1時，葉綠含量會隨著紅光的增高而降低.這可能因為在低光照條件下，葉綠素對638nm紅光的強(qiáng)度更敏感.由于植物體中葉綠素的形成和分解為動態(tài)的過程，在弱光照下，相對較強(qiáng)的635nm紅光有可能加速了葉綠素的分解或者降低了葉綠素的合成速度.

2.2 光照對根系長度的影響

植物根系作為植物的一個重要的營養(yǎng)器官，在植物的生長過程中為其提供必不可少的養(yǎng)分和水分.由于植物的根系主要生長在地下，人們主要關(guān)注溫度、pH值、水分等對植物根系的影響.而實際上不同的光照條件對根的生長也起著一定的作用［14］.本次實驗采用方形培養(yǎng)皿（立體放置），可以直觀地觀察擬南芥在不同光照條件下根系的生長情況.實驗結(jié)果如圖6～圖8（見第766頁）所示，其中RL表示根系長度（l，mm），NO.LRL（n）表示主根上的側(cè)根數(shù)量.擬南芥主根長度先隨著PPFD的增加而增加.當(dāng)PPFD大于200μmol·m－2·s－1時，主根長度又隨著PPFD的增加而減短（圖6）.圖7和圖8中可以看出紅光與藍(lán)光的PPFD增加時，對主根的生長是先促進(jìn)再抑制.藍(lán)光下主根的飽和點約為40μmol·m－2·s－1，紅光約為120μmol·m－2·s－1.與對主根生長的效應(yīng)相似，紅光對主根上的側(cè)根數(shù)量也是先促進(jìn)后抑制.值得注意的是，圖8中當(dāng)紅光PPFD為0μmol·m－2·s－1時，藍(lán)光PPFD為8μmol·m－2·s－1（對應(yīng)樣品9＃）擬南芥沒有側(cè)根出現(xiàn).而當(dāng)藍(lán)光PPFD為0μmol·m－2·s－1時，紅光PPFD位49μmol·m－2·s－1（對應(yīng)樣品25＃），平均出根數(shù)為5.73.表明紅光有促進(jìn)側(cè)根萌發(fā)的作用.

圖8 在10～374μmol·m－2·s－1 LED光照環(huán)境下根長和側(cè)根數(shù)量隨紅光光量子通量強(qiáng)度的變化Fig.8 RL and NO.LRL change with red light PPFD in LED light environment，when total PPFD vary from 10μmol·m－2·s－1 to 374μmol·m－2·s－1

3 結(jié)論與討論

在光環(huán)境設(shè)計中，由于熒光燈不能單獨控制其紅藍(lán)光部分，不能分別測量其紅藍(lán)光的PPFD值，因此不考慮熒光燈的紅藍(lán)光質(zhì)比.由于存在測量誤差且LED照明是需要一定的穩(wěn)定時間，所以測得的LED光環(huán)境下的總光量子通量密度并不一定等于紅藍(lán)光光量子通量密度之和.整體實驗設(shè)置中，LED實驗箱①的光量子通量密度高于實驗箱②.這種實驗光環(huán)境設(shè)計主要用于不同LED光照強(qiáng)度下的樣品之間的對比.

現(xiàn)有實驗數(shù)據(jù)表明，在對比熒光燈組與LED照明組時，相同的光量子流密度下（64μmol·m－2·s－1），熒光燈和LED燈下樣品的葉綠素a＋b平均含量分別為1.45mg·g－1和1.52mg·g－1，兩者相差0.07mg·g－1.在現(xiàn)有的實驗數(shù)據(jù)上，擬南芥的根系長度隨著PPFD的增加先增后降.主根長度的飽和值在紅光下約為120μmol·m－2·s－1，藍(lán)光下約為40μmol·m－2·s－1.當(dāng)紅光PPFD值增加時，主根上側(cè)根的數(shù)量先增加后減少，頂點出現(xiàn)在約200μmol·m－2·s－1處.實驗中沒有找到主根上側(cè)根數(shù)量相對應(yīng)藍(lán)光PPFD的飽和點.本實驗中的樣本數(shù)據(jù)量較少，在后續(xù)的實驗中應(yīng)本實驗的基礎(chǔ)上適量增加樣本數(shù).本實驗中只做了一個PPFD強(qiáng)度下的LED與熒光燈的對照組.后續(xù)工作中應(yīng)增加不同PPFD水平下的對照組并增加樣本數(shù)量，驗證在不同PPFD水平下的LED葉綠素和跟長的變化趨勢，同時可以增加觀測的參數(shù)和增加測試周期.

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