HPLC檢測(cè)青霉素鈉和頭孢他啶殘留方法的研究

袁果園 王云帆 熊偉

(重慶科技學(xué)院安全工程學(xué)院，重慶 401331)

我國(guó)每年抗生素原料產(chǎn)量約為21萬t，其中有9.7 萬 t用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)［1］。王云鵬等人［2］對(duì)國(guó)內(nèi)5省市進(jìn)行的養(yǎng)殖業(yè)抗生素的使用情況調(diào)查表明飼養(yǎng)場(chǎng)濫用抗生素現(xiàn)象相當(dāng)嚴(yán)重。雖然使用抗生素有可能降低養(yǎng)殖成本，但長(zhǎng)期使用抗生素可誘導(dǎo)耐藥菌的出現(xiàn)［3］。在肉制品中，抗生素殘留量不是很大，但人們長(zhǎng)期食用后，可在體內(nèi)大量蓄積，給人體健康帶來危害［4］。在污水處理廠和廢水中，已檢測(cè)出耐藥性和多種耐藥性細(xì)菌，這些細(xì)菌很可能通過污水灌溉、污泥施肥等方式進(jìn)入食物鏈［5］。殘留在飲用水中的抗生素，長(zhǎng)期飲用將降低人體免疫力［6］。部分藥物有致癌、致突變等作用，嚴(yán)重干擾了人體各項(xiàng)生理功能［7］。

抗生素中β－內(nèi)酰胺類是一種種類繁多的抗生素，包括臨床最常用的青霉素與頭孢菌素等。此類抗生素因殺菌活性強(qiáng)、毒性低、適應(yīng)癥廣及臨床療效好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于治療和預(yù)防各種疾病。隨著人們生活和衛(wèi)生水平的不斷提高以及β－內(nèi)酰胺類抗生素逐漸成為抗菌的重點(diǎn)藥物，β－內(nèi)酰胺類的需求量將繼續(xù)增長(zhǎng)，這將給國(guó)內(nèi)的β－內(nèi)酰胺類酰胺類抗生素產(chǎn)品提供更為廣闊的市場(chǎng)，且在今后相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)，仍是抗生素發(fā)展的主流。因此，研究一種快速精確檢測(cè)食品和環(huán)境中多種抗生素殘留的方法是非常必要的。常用的TTC檢測(cè)法［8］和紙片檢測(cè)法［9］的精密度和準(zhǔn)確度不高，且易受其他抗菌藥物的干擾;免疫分析法［10］和試劑盒法［11］的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，樣品前處理較復(fù)雜，同時(shí)也很難進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè);化學(xué)發(fā)光法［12］和熒光分光光度法［13］的樣品預(yù)處理復(fù)雜，流程繁瑣，設(shè)備昂貴，需要專業(yè)技術(shù)人員等，很難實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和推廣。

HPLC是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，采用了由全多孔或非多孔高效微粒固定相制備的色譜柱，有高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，用高靈敏度檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了高柱效、高選擇性、高靈敏度的快速分析，并成為有機(jī)物定量分析的主要分析工具。本文以β－內(nèi)酰胺類藥物——青霉素鈉和頭孢他啶為樣本，通過優(yōu)化HPLC的檢測(cè)條件，來實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Science高效液相色譜系統(tǒng)，包括P680高壓梯度溶劑輸送泵，AD25紫外—可見檢測(cè)器和LC20柱溫箱;Ultimate XB－C18色譜柱(4.6 mm×250 mm Column 5－Micron);超純水系統(tǒng);針筒式微孔濾膜過濾器(天津騰達(dá)過濾器件廠);450 nm微孔濾膜(上海新亞有限責(zé)任公司);數(shù)控超聲波清洗器(南京壘君達(dá)超聲電子設(shè)備有限公司);PHS－3C型實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)(榮慶計(jì)量檢測(cè)儀器有限公司);砂芯過濾裝置(天津市領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

甲醇，色譜純(成都市科龍化工試劑廠);磷酸，色譜純(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

1.2 溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.025 g青霉素鈉和頭孢他啶，于25 mL容量瓶中，加入10 mL超純水，搖勻，待完全溶解，冷卻后，用超純水定容至刻度，并搖勻，配制成濃度為1 mgmL的青霉素鈉和頭孢他啶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封，4℃冷藏保存。

取480 mL超純水于燒杯中，加入2 mL磷酸，搖勻，用過濾器過濾，濾膜是450 nm微孔濾膜，得到流動(dòng)相A。

1.3 色譜條件

流動(dòng)相A為水磷酸溶液;流動(dòng)相B為甲醇。流速為1 mLmin，進(jìn)樣量為 10 μL，柱溫為 25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相組成配比的優(yōu)化

青霉素鈉流動(dòng)相組成配比中甲醇分別為30%、35%、40%的色譜圖分別見圖1、圖2、圖3。出峰時(shí)間分別為8.507、7.242、5.560 min。在多種成分的檢測(cè)中，應(yīng)盡量使出峰在溶劑峰之后，取保留時(shí)間較短為好，因此甲醇為30%時(shí)為最優(yōu)流動(dòng)相配比。

圖1 青霉素鈉流動(dòng)相組成配比中甲醇為30%的色譜圖(出峰時(shí)間為6.8 min)

圖2 青霉素鈉流動(dòng)相組成配比中甲醇為35%的色譜圖(出峰時(shí)間為4.2 min)

圖3 青霉素鈉流動(dòng)相組成配比中甲醇為40%的色譜圖(出峰時(shí)間為8.0 min)

頭孢他啶流動(dòng)相組成配比中甲醇分別為25%、30%、35%的色譜圖分別見圖4、圖5、圖6。出峰時(shí)間分別為5.012、3.900、3.333 min，因此甲醇為25%時(shí)為最優(yōu)流動(dòng)相配比。

圖4 頭孢他啶流動(dòng)相組成配比中甲醇為25%的色譜圖(出峰時(shí)間為4.6 min)

圖5 頭孢他啶流動(dòng)相組成配比中甲醇為30%的色譜圖(出峰時(shí)間為3.7 min)

圖6 頭孢他啶流動(dòng)相組成配比中甲醇為35%的色譜圖(出峰時(shí)間為3.2 min)

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化

不同波長(zhǎng)下檢測(cè)得到的青霉素鈉和頭孢他啶的液相圖譜峰面積見表1。在282 nm時(shí)青霉素鈉的色譜峰面積最大，出峰最明顯，因此282 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。在260 nm時(shí)頭孢他啶的色譜峰面積最大，出峰最明顯，因此260 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 線性關(guān)系、檢出限和重復(fù)性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在10～1000 ngmL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系R2均大于0.990。采用3倍信噪比計(jì)算檢出限，其中青霉素鈉和頭孢他啶檢出限分別是3.5 ngmL 和6.5 ngmL。采用 10 倍信噪比計(jì)算定量下線，結(jié)果見表2。配制10 ngmL和25 ngmL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣4次，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于2%，重現(xiàn)性較好。

表1 青霉素鈉和頭孢他啶在不同波長(zhǎng)下的峰面積

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

圖7和圖8分別為市售某廠家生產(chǎn)的青霉素鈉和頭孢他啶成品藥在優(yōu)化條件下濃度為1 mgmL的檢測(cè)圖譜。

表2 抗生素校正曲線回歸分析、檢出限和定量下限

圖7 成品青霉素鈉的檢測(cè)圖譜

圖8 成品頭孢他啶的檢測(cè)圖譜

圖7、圖8表明在該條件下能夠檢測(cè)出2種物質(zhì)。峰面積分別為830和1151，通過計(jì)算，該成品藥青霉素鈉和頭孢他啶的有效濃度分別為29 ngmg和16 ngmg，因此，成品藥青霉素鈉和頭孢他啶的有效含量分別為2.9%和1.6%。

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