慢病毒的包裝及其對禽細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因效率研究

陳志勝，黃曉敏，廖敬森

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山528000）

慢病毒載體是一種新型轉(zhuǎn)基因載體，以其獨(dú)特的優(yōu)勢成為轉(zhuǎn)基因研究和基因治療中病毒載體的研究熱點(diǎn)。作為外源基因載體，已廣泛地用于體外細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)基因研究，以及結(jié)合RNAi進(jìn)行功能基因組和基因治療研究［1－2］。近幾年來，利用慢病毒為載體對家禽細(xì)胞轉(zhuǎn)基因的操作也進(jìn)行了一些嘗試，但還遠(yuǎn)沒有達(dá)到哺乳動(dòng)物的研究水平。Hen G等［3］研究表明，慢病毒可以攜帶外源基因至受體雞胚中表達(dá)，但是表達(dá)效率極低，僅為0.48%。Chapman S C等［4］用慢病毒載體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞，其種系傳遞率均明顯低于相同載體在小鼠中的報(bào)道。本研究將4種已構(gòu)建好的慢病毒質(zhì)粒pLP1、pLP2、p－VSVG和pll3.7以脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，將其包裝成以VSV－G為囊膜糖蛋白的復(fù)制缺陷型假逆轉(zhuǎn)錄病毒，再用這種包裝產(chǎn)物感染體外培養(yǎng)的雞胚和鴨胚成纖維細(xì)胞，通過綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因作為標(biāo)記基因，觀察其熒光表達(dá)，并檢測其感染效率，從而為重組慢病毒系統(tǒng)在家禽細(xì)胞上的合理使用提供理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)，進(jìn)一步為慢病毒介導(dǎo)法制備轉(zhuǎn)基因家禽的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

4種基于HIV－1的復(fù)制缺陷型慢病毒4種質(zhì)粒系統(tǒng)pLP1、pLP2、p－VSVG、pll3.7以及293T細(xì)胞均由中山大學(xué)發(fā)育生物學(xué)與發(fā)育工程研究室惠贈(zèng)。大腸埃希菌DH5α由本試驗(yàn)室保存。雞、鴨胚成纖維細(xì)胞為原代培養(yǎng)：取8日齡～10日齡的雞、鴨胚，去除頭部、四肢、內(nèi)臟及可見的血管，用2.5g／L的胰蛋白酶－0.2g／L的EDTA 消化液，置于37℃消化10min，得到的細(xì)胞用含100mL／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 以3種不同劑量準(zhǔn)備DNA－脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物：①將4種包裝質(zhì)粒各取5μL，加入到0.25mL無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，并與4μL的脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000混勻；②4種包裝質(zhì)粒各取5μL，與6μL的脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000混勻；③將pLP1、pLP2、p－VSVG質(zhì)粒按6.5∶2.5∶3.5質(zhì)量比進(jìn)行混合（這一比例約相當(dāng)于摩爾等比關(guān)系）制作包裝混合物然后取12.5μL包裝混合物及7.5μL pll3.7質(zhì)粒，共20μL，加入到500μL無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻并加入6μL的脂質(zhì)體；

待293T細(xì)胞在24孔板生長達(dá)到90%～95%融合度時(shí)，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入培養(yǎng)瓶中，并來回輕搖以混勻。37℃孵育過夜；第2天移去含復(fù)合物的培養(yǎng)基，換上新鮮培養(yǎng)液；轉(zhuǎn)染后48h～72h收集含病毒上清，4℃、3 000r／min離心15min，去除細(xì)胞沉淀，取上清，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 包裝病毒的滴度鑒定 病毒轉(zhuǎn)染滴度的簡單測算是通過獲取的病毒原液感染293T細(xì)胞，48h后觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，每瓶細(xì)胞隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行陽性熒光計(jì)數(shù)，利用熒光成像系統(tǒng)分析計(jì)算轉(zhuǎn)染的總細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而估測每毫升病毒原液的滴度［6］。

1.2.3 包裝病毒感染雞、鴨胚成纖維細(xì)胞 將上述凍存的最高滴度慢病毒液解凍后，以1∶1的比例與含100mL／L胎牛血清DMEM培養(yǎng)液混合，其終體積均為1mL。將此稀釋液輕輕倒轉(zhuǎn)混勻，加到六孔板培養(yǎng)的雞、鴨胚成纖維細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后72h觀察孔中GFP的表達(dá)情況，隨機(jī)抽取10個(gè)非重疊視野，利用熒光成像系統(tǒng)分析計(jì)數(shù)表達(dá)GFP的細(xì)胞個(gè)數(shù)占細(xì)胞總數(shù)百分比最終得出其轉(zhuǎn)染效率。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒4種質(zhì)粒系統(tǒng)在293T細(xì)胞中的包裝及其滴度檢測

不同濃度的4種質(zhì)粒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)，取病毒上清液感染293T后同樣觀察到綠色熒光表達(dá)，表明293T細(xì)胞成功地包裝制備了重組慢病毒，但其轉(zhuǎn)染效率與質(zhì)粒和脂質(zhì)體的相對濃度相關(guān)。3種轉(zhuǎn)染方法中，當(dāng)4種質(zhì)粒濃度按6.5∶2.5∶3.5∶7.5比例混勻共20μL并與6 μL脂質(zhì)體共同分散于500μL的DMEM時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高（35%），即GFP拷貝數(shù)多，表達(dá)量高，熒光強(qiáng)。此外，在轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞時(shí)，如4種質(zhì)粒比例相同條件下，高濃度脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率高。分別收集3種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的病毒上清液進(jìn)行滴度檢測可知，本試驗(yàn)3種方法中慢病毒的生產(chǎn)體系所獲得的病毒滴度分別約為0.1×104，9.5×104，1.7×105PFU／mL（圖1）。

圖1 3種方法的轉(zhuǎn)染效率及獲得的包裝病毒滴度比較Fig.1 Transfection efficiency and packaging viral titer in 3methods

2.2 慢病毒載體感染雞、鴨胚成纖維細(xì)胞的效率

經(jīng)293T細(xì)胞包裝制備的重組慢病毒（病毒滴度約為1.7×105PFU／mL）感染雞、鴨胚成纖維細(xì)胞，感染72h后，可見感染細(xì)胞內(nèi)有不同程度綠色熒光蛋白表達(dá)，表明家禽成纖維細(xì)胞可以吸附重組慢病毒并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因。慢病毒對細(xì)胞的感染力直接反映在帶綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量上（圖2）。經(jīng)計(jì)數(shù)其感染效率在雞、鴨胚成纖維細(xì)胞上分別為12% 和8%。

圖2 慢病毒感染雞、鴨胚成纖維細(xì)胞時(shí)GFP的表達(dá)情況Fig.2 GFP expression in chicken and duck embryonic fibroblast cells after lentiviral particle infection

3 討論

慢病毒載體是一類新型的基因轉(zhuǎn)移載體，相比其他基因轉(zhuǎn)移方法，慢病毒載體因具有可以感染非分裂期細(xì)胞，并能實(shí)現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)，容納外源性目的基因片段大，免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)越來越受到人們的重視［7－8］。本試驗(yàn)采用的慢病毒4種質(zhì)粒包裝系統(tǒng)拓寬了載體的嗜性范圍，增加了載體的穩(wěn)定性且重組進(jìn)標(biāo)記基因GFP，可以標(biāo)識(shí)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。選用人胚腎細(xì)胞來源的293T作為包裝細(xì)胞，使其在包裝過程中能反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白。結(jié)果表明此法包裝好的慢病毒可成功感染雞、鴨胚成纖維細(xì)胞。

3.1 慢病毒載體包裝條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)中，在暴露時(shí)間一定時(shí)，不同比例的慢病毒4種質(zhì)粒和不同劑量的脂質(zhì)體對293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果的影響不同。4種質(zhì)粒DNA按6.5∶2.5∶3.5∶7.5質(zhì)量比轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)到35%，病毒滴度為1.7×105IU／mL。說明不同的慢病毒成分需要達(dá)到合理比例才能獲得較好的包裝效果。必要數(shù)量的質(zhì)?；旌媳壤寝D(zhuǎn)基因表達(dá)所必需的，但本試驗(yàn)中增加慢病毒載體4種質(zhì)粒的比例并不能使轉(zhuǎn)染效率提高，這說明細(xì)胞對慢病毒質(zhì)粒DNA的攝取是有一定限度的，高濃度的4種質(zhì)?；旌媳壤赡苁窍拗妻D(zhuǎn)染的重要因素。這可能是因?yàn)榇髣┝抠|(zhì)粒長時(shí)間作用于細(xì)胞造成細(xì)胞損傷或?qū)?xì)胞的毒性所致，使細(xì)胞死亡率升高，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。這一結(jié)論與于建寧的研究結(jié)論一致［9］。本研究獲得的病毒滴度比其他文獻(xiàn)報(bào)道的低［10－12］，一方面可能是由不同的研究中慢病毒生產(chǎn)和病毒滴度估測的方法不同造成的，另一方面我們的試驗(yàn)方法尚需要進(jìn)一步優(yōu)化。實(shí)際上，收集慢病毒液上清經(jīng)過超速離心，可以進(jìn)一步濃縮病毒從而增加滴度，因此在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)將病毒液超速離心幾乎是必不可少的。

3.2 慢病毒載體對雞、鴨胚成纖維細(xì)胞的感染效率

在不同物種來源的細(xì)胞中，慢病毒載體有不同的轉(zhuǎn)染效率。目前己有利用慢病毒生產(chǎn)出高整合率轉(zhuǎn)基因小鼠報(bào)道，但在轉(zhuǎn)基因家禽生產(chǎn)中還僅有少量成功的報(bào)道［3－5］。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在雞、鴨胚成纖維細(xì)胞中分別有12%和8%的細(xì)胞表達(dá)熒光，說明本試驗(yàn)生產(chǎn)的慢病毒對家禽成纖維細(xì)胞有較好的感染能力。但感染效率仍不理想，可能與病毒粒子的宿主特異性相關(guān)，慢病毒各組分都是基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得，因此病毒可能較難吸附到禽類細(xì)胞。

本試驗(yàn)優(yōu)化了慢病毒4種質(zhì)粒的包裝效率，并成功感染雞、鴨胚成纖維細(xì)胞，為重組慢病毒系統(tǒng)的在家禽的使用提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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