雞傳染性法氏囊病病毒RT－PCR 檢測方法的建立與應(yīng)用

孫 潔，盧體康，曾少靈，楊俊興，詹愛軍，林慶燕，曹琛福，陳 兵，

廖立珊1，阮周曦1，陶 虹1，張彩虹1，劉建利1，花群義1，3，呂建強1，3，秦智鋒1、2，3＊

（1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳市518001；2.深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東深圳市518001；3.深圳市外來有害生物質(zhì)檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣東深圳518045）

雞傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）又稱雞傳染性腔上囊病，是由傳染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一種家禽急性、接觸傳染性的烈性傳染病。目前本病是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病之一，呈世界性分布，以法氏囊發(fā)炎、壞死、萎縮和法氏囊內(nèi)淋巴細胞嚴重受損為特征，從而引起雞的免疫機能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果。隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)和對外貿(mào)易的不斷發(fā)展，我國近年來頻繁引進種雞、種蛋和家禽產(chǎn)品，對引進的種雞、種蛋和家禽產(chǎn)品的檢疫已成為動物檢疫的一個重要工作。在對引進的種雞和種蛋的進出境檢疫過程中，鑒于雞傳染性法氏囊病傳染方式廣泛，可隨蛋進行垂直傳播的特性，因此，世界各國均對此病進行重點防控，是各國進出口種雞、種蛋和家禽產(chǎn)品必定檢疫的項目之一。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）也將此病進行收錄，認為其是影響國際動物及其產(chǎn)品貿(mào)易的重大動物疫?。?－5］。我國農(nóng)業(yè)部2009年公布的《一、二、三類動物疫病病種名錄》中，把本病列為二類動物傳染病進行重點防控。到目前為止，我國有關(guān)雞傳染性法氏囊病的標準有2個，但缺少必要的快速分子生物學診斷方法［6－8］。近10年來，RT－PCR 和實時熒光定 量 RT－PCR 技 術(shù) （Real－time RT－PCR，rRTPCR）在3h～4h內(nèi)快速診斷田間樣品方面取得了快速發(fā)展［9］。本研究借助普遍使用的分子生物學檢測技術(shù)，建立了特異性快速檢測IBDV的RT－PCR和rRT－PCR方法，并對田間樣品進行了大量普查監(jiān)測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 傳染性法氏囊病疫苗－法倍靈（IBDVBLEN），購自美國梅里亞公司；傳染性法氏囊標準毒株（CJ801－BKF）由華南農(nóng)業(yè)大學饋贈；傳染性法氏囊病湖北分離株（IBDV－HB）、傳染性法氏囊病武漢分離株（IBDV－WH）、傳染性法氏囊病強毒廣東分離株（IBDV －GDW）和廣西分離株（IBDV－GX），新城疫病毒、馬立克病病毒、傳染性支氣管炎病毒均為本室分離鑒定保存；禽流感病毒H5亞型抗原、禽流感病毒H7亞型抗原和禽流感病毒H9亞型抗原，購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.2 試劑 一步法實時熒光定量RT－PCR試劑盒：AgPath－IDTMOne－Step RT－PCR Kit，ABI公司產(chǎn)品；一步法RT－PCR試劑盒：QIAGEN OneStep RT－PCR Kit，Qiagen公司產(chǎn)品；一步法 RT－PCR試劑盒：TaKaRa OneStep RT－PCR Kit，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；病毒核酸抽提試劑盒：Qiagen Viral RNA Mini Kit，Qiagen公司產(chǎn)品。

1.1.3 設(shè)備 ABI 7500HT熒光定量PCR儀，Qiagen EZ1advanced全自動核酸抽提工作站，核酸蛋白分析儀。

1.2 方法

1.2.1 引物與探針的設(shè)計 采用OIE推薦的IBDV的引物，具體如下：

針對A片段VP2基因的引物：

引物由3段序列組成：由5′端到3′端依次為通用引物M13或R13（黑體部分）序列，限制性內(nèi)切酶位點（下劃線部分），IBDV特異性序列（斜體部分）。M13或R13序列為多數(shù)測序反應(yīng)中的測序引物，便于對PCR擴增產(chǎn)物測序。限制性內(nèi)切酶位點的引入，使得IBDV經(jīng)RT－PCR擴增后的產(chǎn)物可用限制性內(nèi)切酶SphⅠ（引物U3）、EcoRⅠ（引物L3和＋290）、PstⅠ（引物－861）進行酶切后連入載體中。引物U3和L3分別對應(yīng)Acc No X84034毒株序列片段A的657～676和1193～1212位置，引物＋226和－861分別對應(yīng)Acc No AF240687毒株序列片段B中的290～311和861～883位置。A片段擴增產(chǎn)物為604bp，B片段擴增產(chǎn)物為642bp，引物擴增片段適合進行IBDV分子進化分析和流行病學研究。

將各個年代、各個毒力、各個地區(qū)的主要代表毒株的A片段VP2全基因序列下載，用bioEdit（7.0.9.0）軟件，以Clusal W方式進行排列，找出IBDV最保守的21個寡核苷酸來設(shè)計探針，再在探針兩側(cè)保守區(qū)域設(shè)計特異性的上、下游引物。引物和探針采用Primer Express 2.0軟件進行評價［4］。設(shè)計的引物與探針序列見表1，探針的5′端用FAM標記，探針的3′端用BHQ基團淬滅，引物和探針均由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成（表1）。

用無DNA酶、無RNA酶水將每條引物與探針配制成100μmol／L儲存液，置－20℃或更低溫度凍存。使用時引物配制成10μmol／L工作液，探針配制成5μmol／L工作液，避免多次凍融。

表1 雞傳染性法氏囊病病毒引物與探針Table 1 Primers and probes for IBDV

1.2.2 兩種RT－PCR檢測方法的復核與優(yōu)化 參照QIAamp Viral RNA Mini Kit操作說明書，于全自動核酸抽提工作站中抽提IBDV－BLEN、CJ801－BKF、IBDV－HB、IBDV－WH、IBDV－GDW 和IBDVGX、新城疫病毒、馬立克病病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒H5、H7和H9亞型標準HI檢測抗原等11株病毒的核酸和陰性對照尿囊液中的病毒核酸。

按照 OIE推薦的IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR檢測方法的步驟和程序，采用TaKaRa公司一步法RT－PCR檢測試劑盒和Qiagen公司一步法RT－PCR檢測試劑盒，對IBDVBLEN、CJ801－BKF、IBDV－HB、IBDV－WH、IBDV－GDW、IBDV－GX和對照病毒進行檢測。

在此基礎(chǔ)上，以TaKaRa公司一步法RT－PCR檢測試劑盒，對兩種RT－PCR檢測方法進行優(yōu)化，以建立適合我 國 的IBDV－VP2（604）－RT－PCR 和IBDV－VP1（642）－RT－PCR檢測方法。

1.2.3 IBDV－VP2－rRT－PCR的建立 選取1.2.2抽提好的核酸，參照ABI公司AgPath－IDTMOne－Step RT－PCR Kit操作說明書配制熒光定量RTPCR反應(yīng)液：每個25μL的反應(yīng)體系中包含2×RT－PCR母液12.5μL，酶混合物1μL，10μmol／L IBDV－FP 1 μL，10 μmol／L IBDV－RP 1 μL，5μmol／L IBDV－Pb 1μL，無核酸酶的水3.5μL，RNA模板5μL。

于ABI 7500熒光PCR儀進行實時PCR擴增。反應(yīng)程序如下：50℃45min；95℃10min；95℃10 s，60℃30s重復40個循環(huán)，設(shè)置60℃ 時收集FAM熒光報告基團。

1.2.4 OIE推薦的兩種RT－PCR檢測方法與IBDV－VP2－rRT－PCR檢測方法靈敏度比對 選取IBDV－BLEN弱毒疫苗株，用無核酸酶的水10倍系列稀釋成1×10－1～10－10等10個稀釋度，重新抽提核酸。按照 OIE推薦的IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR 兩 種 RT－PCR 檢 測 方法，與所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR 方法進行靈敏度檢測比對，確定所建立方法的靈敏度。

1.2.5 IBDV－VP2－rRT－PCR特異性試驗 用建立的IBDV－VP2－rRT－PCR方法，對6株IBDV毒株進行檢測，確定所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR檢測方法特異性。利用本研究所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR檢測方法，對實驗室保存的雞肉正常組織、雞血清樣品、火雞肌肉組織、鴿組織、正常雞胚尿囊液、其他家禽病毒和細菌共12份非IBDV病毒樣品進行檢測，進一步確定所建立方法的特異性。

1.2.6 田間試驗 自2007年以來，采用所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR檢測方法，對注冊禽場采集18批221份樣品進行雞傳染性法氏囊病毒監(jiān)測。發(fā)現(xiàn)陽性則用雞胚進行病毒分離鑒定和用IBDVVP2（604）－RT－PCR 和 IBDV－VP1（642）－RT－PCR檢測確證。

2 結(jié)果

2.1 兩種RT－PCR檢測方法的優(yōu)化結(jié)果

按照 OIE推薦的IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR檢測方法的步驟和程序，采用Qiagen公司的一步法RT－PCR檢測試劑盒，IBDV－VP2（604）－RT－PCR 可以檢測出604bp條帶，IBDV－VP1（642）－RT－PCR 可以檢測出642bp條帶，但條帶微弱。采用TaKaRa公司一步法RTPCR檢測試劑盒，則兩種RT－PCR結(jié)果均為陰性。

以Qiagen公司一步法RT－PCR檢測試劑盒，對兩種RT－PCR檢測方法的反應(yīng)條件反復進行優(yōu)化，確定了最佳的反應(yīng)條件為：第一步：反轉(zhuǎn)錄50℃45min；第二步：94℃5min（如果為熱啟動一步法RT－PCR試劑盒，則需要95℃15min）；第三步：94℃30s，54℃45s，72℃1min 30s，5個循環(huán)；第四步：94℃30s，64℃45s，72℃1min 30s，30個循環(huán)；第五步：72℃延伸10min。對6株IBDV毒株用優(yōu)化后的方法進行檢測，結(jié)果見圖1。

2.2 IBDV－VP2－rRT－PCR的建立

在25μL反應(yīng)體系中，在設(shè)定的反應(yīng)條件下于ABI 7500熒光定量PCR儀上進行IBDV－VP2－rRT－PCR檢測。在陰性對照成立的情況下，6株IBDV毒株出現(xiàn)特異性的實時擴增，其他禽病病毒和陰性組織樣品均沒出現(xiàn)特異性擴增，相互之間無交叉反應(yīng)。6株IBDV 毒株IBDV－BLEN、CJ801－BKF、IBDV－HB、IBDV－WH、IBDV －GDW 和 IBDV－GX 的 Ct 值 分 別 為 23.93、23.55、16.46、14.28、19.53、14.37；陰性對照無擴增信號（圖2）。

2.3 三種分子生物學檢測方法靈敏度比較結(jié)果

將10倍系列稀釋的IBDV－BLEN弱毒疫苗株，用 OIE 推 薦 的IBDV－VP2（604）－RT－PCR、IBDVVP1（642）－RT－PCR 檢測方法和IBDV－VP2－rRTPCR檢測方法進行測定。結(jié)果顯示，所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR檢測方法的靈敏度為 10－4（圖3），IBDV－VP2（604）－RT－PCR 檢測方法和IBDVVP1（642）－RT－PCR 檢測方法的靈敏度相當，均為10－3（圖4），比所建立的rRT－PCR檢測方法的靈敏度低10倍。所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR檢測方法 檢 測 IBDV－BLEN、CJ801－BKF、IBDV－HB、IBDV－WH、IBDV－GDW 和IBDV－GX 等6株IBDV毒株的檢出率為100%（6／6），無漏檢現(xiàn)象發(fā)生。

圖1 6株IBDV毒株用優(yōu)化的IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR檢測結(jié)果Fig.1 The results of IBDV－VP2（604）－RT－PCR and IBDV－VP1（642）－RT－PCR for 6IBDV strains

2.4 IBDV－VP2－rRT－PCR特異性試驗結(jié)果

對6株IBDV毒株用建立的IBDV－VP2－rRTPCR檢測方法進行檢測，均能特異性地檢測出6株IBDV毒株，其他家禽病毒均沒有擴增結(jié)果。表明所建立的方法特異性強，相互之間無交叉反應(yīng)（圖2）。通過對12份非IBDV樣品的檢測，結(jié)果全部為陰性，表明所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR檢測方法的特異性為100%（18／18）。說明該方法特異性強，與其他檢測對象無交叉反應(yīng)。

圖2 6株IBDV毒株IBDV－VP2－rRT－PCR檢測結(jié)果Fig.2 The results of IBDV－VP2－rRT－PCR for 6IBDV strains

圖3 IBDV－VP2－rRT－PCR檢測IBDV－BLEN弱毒疫苗株的靈敏度測定結(jié)果Fig.3 Sensitivity of the IBDV－VP2－rRT－PC for IBDV－BLEN vaccine

2.5 田間試驗結(jié)果

2007年－2011年采集注冊禽場血液和組織樣品18批221份田間樣品進行普查監(jiān)測，雞傳染性法氏囊病普查監(jiān)測表明，IBDV－VP2－rRT－PCR篩選檢測陽性共8份，陽性率為3.62%。樣品經(jīng)雞胚尿囊膜接種后，再采用IBDV－VP2（604）－RT－PCR 和IBDV－VP1（642）－RT－PCR方法檢測，結(jié)果完全相符。

3 討論

3.1 建立傳染性法氏囊病病毒分子生物學檢測的意義和必要性

近年來，傳染性法氏囊病的流行出現(xiàn)了新的特點，其臨床癥狀呈不典型性，免疫失敗現(xiàn)象亦非常嚴重，因此對本病的早期診斷就顯得尤為重要。IBD的實驗室常規(guī)診斷方法有瓊脂糖凝膠擴散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、病毒中和試驗（VN）等。這些方法在特異性、敏感性和時效性等方面存在著一定的不足，不利于疫情的早期發(fā)現(xiàn)［10－14］。隨著科學技術(shù)的發(fā)展和對IBDV的深入研究，新的診斷方法不斷涌現(xiàn)，尤其是分子生物學診斷技術(shù)以其靈敏、快速、特異性強等優(yōu)點在IBD的早期診斷中得到了廣泛的應(yīng)用［15－16］。本研究建立的IBDV普通 RT－PCR方法和熒光定量RT－PCR方法將為今后IBD的快速診斷、病原學研究提供了有力的工具。

圖4 IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR檢測IBDV－BLEN弱毒疫苗株的靈敏度測定結(jié)果Fig.4 Sensitivity of the IBDV－VP2（604）－RT－PCR and IBDV－VP1（642）－RT－PCR for IBDV－BLEN vaccine

3.2 IBDV－VP2－rRT－PCR與普通RT－PCR檢測靈敏度和特異性比較

本研究建立的普通RT－PCR方法分別針對了IBDV的VP1和VP2基因片段中的保守序列，引物擴增片段適合進行IBDV分子進化分析和流行病學研究；IBDV－VP2－rRT－PCR方法針對 VP2基因，兩種方法均可以特異性地檢測IBDV，與其他病毒之間不存在交叉性。

OIE推薦的四步反應(yīng)條件中PCR的擴增步驟為：94℃30s，64℃45s，72℃1min 30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。這個反應(yīng)條件采用進口的Qiagen公司的一步法RT－PCR檢測試劑可以擴增出2個目的片段，但擴增效率不高，有時條帶比較微弱。鑒于PCR引物人工加尾太長，如果采用太高的退火溫度可能導致PCR擴增之初不能使引物與模板有效結(jié)合，導致擴增效率不高或產(chǎn)生非特異性擴增。為了提高特異生，所以在PCR擴增之前增加了一個低的退火溫度54℃，進行5個循環(huán)的預(yù)擴增。等擴增出帶有引物的片段后，再在高的退火溫度64℃條件下進行擴增，結(jié)果無論是采用國產(chǎn)的還是進口的一步法RTPCR檢測試劑盒，均可有效地擴增出相應(yīng)的目的條帶。

實時熒光定量PCR由于具有靈敏、準確、快速的特點而被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于人醫(yī)的臨床檢測和獸醫(yī)的臨床診斷。目前，實時熒光定量PCR檢測方法已在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)、檢驗檢疫系統(tǒng)廣泛使用。RT－PCR檢測方法和實時熒光定量RT－PCR檢測方法雖然都可以對IBD進行確診，相對于普通RT－PCR方法，本研究建立的IBDV－VP2－rRT－PCR方法的檢測靈敏度比普通RT－PCR方法高10倍，同時摒棄了傳統(tǒng)電泳方法，時效性更佳，實現(xiàn)了對IBDV的實時檢測監(jiān)控，為IBD的防控奠定了基礎(chǔ)。

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