副豬嗜血桿菌和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌雙重PCR 檢測方法的建立及應(yīng)用

余遠(yuǎn)迪，曾 澤，岳 華，張 斌

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是普通豬上呼吸道的一種共棲菌，能在特定條件下侵入機(jī)體而引起嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征。主要臨診癥狀為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行、共濟(jì)失調(diào)和被毛粗亂等，剖檢病理變化表現(xiàn)為胸膜炎、肺炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等；主要危害2周齡～8周齡的仔豬，發(fā)病率一般為10%～15%，病死率可達(dá)50%以上［1－2］。豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）是豬傳染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）的致病菌，以急性出血和慢性纖維素性壞死性胸膜炎病變?yōu)橹饕卣?，慢性癥狀表現(xiàn)為可造成豬生長緩慢的肺損傷，給世界各地養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［3］。在臨床診斷中，很難通過臨床癥狀和病理特征鑒別這兩種疾病的混合感染。而傳統(tǒng)的鑒別診斷方法，即病原分離和血清學(xué)診斷，由于敏感性和特異性不高，不能滿足快速鑒別診斷的需要，所以建立一種快速準(zhǔn)確的病原檢測方法尤為重要。多重PCR作為一種特殊的PCR比單項PCR更加快捷和簡便，已應(yīng)用于診斷多種疾病的混合感染［4－6］。本 試 驗 根 據(jù) Hps 16SrRNA 序 列 和 App ApxIVA基因序列各設(shè)計一對引物，通過特異性和敏感性試驗，建立了可快速鑒別檢測副豬嗜血桿菌和豬傳染性胸膜放線桿菌的雙重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與毒株 Hps菌株參考血清1型（HS82）、2型（HS83）、3型（HS81）、4型（HS79）、5型（HS80）、6 型 （HS1072）、7 型 （HS1073）、8 型（HS1073）、9 型 （HS50）、10 型 （HS1076）、11 型（HS1077）、12 型 （HS1075）、13型 （HS1079）、14 型（HS1080）、15型（HS1081）、100株 Hps臨床分離株（SWUN050～SWUN151），App參考菌株血清1型（CVCC259）、血 清 2 型 （CVCC260）、血 清 3 型（CVCC261）、血 清 4 型 （CVCC262）、血 清 5 型（CVCC263）、血 清 6 型 （CVCC264）、血 清 7 型（CVCC265）、血 清 8 型 （CVCC266）、血 清 9 型（CVCC267）、血 清 10 型 （CVCC268）、血 清 11 型（CVCC269）、血清12型（CVCC270），15株 App臨床分離株（SWUN170～SWUN182），支氣管敗血波氏桿菌（SWUN200）、豬源多殺性巴氏桿菌（SWUN201）、豬源大腸埃希菌（SWUN203）、豬源沙門菌（SWUN204）、豬源金黃色葡萄球菌（SWUN205）、豬圓環(huán)病毒2型（SWUN061）、豬流感病毒（H1N1）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（疫苗株）、大腸埃希菌JM109菌株為本實驗室分離鑒定并保存（表1）。

1.1.2 主要試劑及試劑盒 胰蛋白酶胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）為青島海博生物有限公司產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）為Sigma公司產(chǎn)品；MgCl2、dNTP、r Taq聚合酶和pMD19－T Vector等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒為Omega生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 參照文獻(xiàn)［7］根據(jù) Hps 16SrRNA序列設(shè)計引物，預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為822bp，引物序列 為，PH1：5′ GTGATGAGGAAGGGTGGTGT3′；PH2：5′GGCTTCGTCACCCTCTGT3′。參照文獻(xiàn)［8］根據(jù)App ApxIVA基因設(shè)計引物，預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為346bp，引物序列為，PA1：5′ATACGGTTAATGGCGGTAATGG3′；PA2：5′ACCTGAGTGCTCACCAACG3′。以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Hps與App的培養(yǎng) 將參考菌株 Hps和App分別接種于含有50mL／L小牛血清和0.1 mL／L的NAD的TSA平板上，37℃培養(yǎng)24h～48 h，單個菌落進(jìn)行革蘭染色，觀察結(jié)果，保存?zhèn)溆?；從TSA平板上挑取單菌落培養(yǎng)于50mL／L小牛血清和0.1mL／L的NAD的TSB培養(yǎng)基中，置于37℃，150r／min振搖培養(yǎng)24h。

1.2.2 DNA模板的制備 細(xì)菌DNA模板制備：按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作；組織中DNA的提取：按組織DNA提取試劑盒說明書操作。

1.2.3 單項PCR擴(kuò)增制備陽性標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品采用25μL反應(yīng)體系：DNA模板1μL，上游引物1 μL，下游引物1μL，10×PCR buffer 2.5μL，dNTP（2.5mmol／L）2μL，MgCl21.5μL，rTaq1U，無菌雙蒸水15.8μL。以下反應(yīng)條件分別擴(kuò)增Hps 16S rRNA片段和App ApxIVA片段：94℃5min；94℃30s，58℃40s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，16℃反應(yīng)結(jié)束。PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色，小量膠回收試劑盒回收目的片段，分別連接pMD19－T Vector，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM109。陽性克隆質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果正確的陽性質(zhì)粒用核酸蛋白檢測儀測定OD 260nm值，計算其濃度，將兩種陽性質(zhì)粒調(diào)整至相同濃度，等量混合，即為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4 雙重PCR方法的建立 以陽性標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在Hps、App單項PCR穩(wěn)定的基礎(chǔ)以25μL總體積，優(yōu)化反應(yīng)體系。對退火溫度（52℃～62℃）進(jìn)行優(yōu)化，再以優(yōu)化的退火溫度對兩對引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，以電泳條帶最亮，無非特異擴(kuò)增，引物二聚體最少，敏感性最高為優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 雙重PCR特異性試驗 以相同條件擴(kuò)增本實驗保存的波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、豬圓環(huán)病毒2型、豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組模板，檢測該雙重PCR方法的特異性。

1.2.6 多重PCR的敏感性試驗 分別用單項和雙重PCR檢測10倍系列稀釋陽性模板，初始模板濃度為3.8μg／mL，模板稀釋6個梯度，為10－1～10－6。將Hps和App純培養(yǎng)后，用PBS將細(xì)菌洗下，細(xì)菌計數(shù)測定細(xì)菌濃度，用PBS將其從10－1～10－6進(jìn)行10倍稀釋，各取1μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.7 多重PCR的通用性試驗 用Hps 15個標(biāo)準(zhǔn)血清型參考株，100株Hps臨床分離株和12株App標(biāo)準(zhǔn)血清型參考株，15株App臨床分離株進(jìn)行通用性檢測。

1.2.8 臨床樣本的檢測 對36份臨床采集的疑似樣本從肺臟細(xì)支氣管進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)，并從肺臟組織中提取組織DNA，用單項PCR方法及本研究所建立的雙重PCR方法進(jìn)行檢測。

1.2.9 人工感染樣本的檢測 人工感染試驗在本實驗室進(jìn)行，將10頭1月齡仔豬隨機(jī)分為2組飼養(yǎng)，第一組5頭仔豬用濃度為1×109cfu的 Hps標(biāo)準(zhǔn)血清5型菌株氣管注射，接種劑量5mL／頭；第二組5頭仔豬用濃度為1×109cfu的App標(biāo)準(zhǔn)血清5型菌株氣管注射，接種劑量為5mL／頭。注射后每隔1h觀察仔豬臨床癥狀，處死發(fā)病癥狀明顯的仔豬，分別采集其肺組織，用所建立的雙重PCR方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 單項及多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用引物 PH1、PH2、PA1、PA2按文中1.2.3的方法分別擴(kuò)增Hps和App的DNA模板，結(jié)果只擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性片段；同時以Hps和App的DNA為模板時，結(jié)果擴(kuò)增出Hps16SrRNA 822bp和App ApxIVA 346bp 2個片段。陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明所擴(kuò)增的片段為Hps和App目的基因片段（圖1）。

2.2 雙重PCR條件的優(yōu)化

采用25μL反應(yīng)體系，最佳退火溫度為60℃，Hps和 App引物的最佳配比 0.6μmol／L∶1μmol／L（圖2和圖3）。

圖1 Hps和App基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products of Hps and App genes

圖2 雙重PCR退火溫度的優(yōu)化Fig.2 Optimization of annealing temperature in duplex PCR

圖3 雙重PCR引物濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization of primer concentration in duplex PCR

2.3 雙重PCR特異性試驗結(jié)果

檢測結(jié)果表明，多重PCR方法可特異性地擴(kuò)增Hps和App目的片段，不與豬源波氏桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌、豬源大腸埃希菌、豬源沙門菌、豬源金黃色葡萄球菌、豬圓環(huán)病毒2型、豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，說明該方法具有較高的特異性（表1）。

表1 雙重PCR方法特異性試驗結(jié)果Table 1 The results of specificity tests of duplex PCR

2.4 雙重PCR敏感性試驗結(jié)果

2.4.1 最低檢測核酸濃度 該方法對Hps和App重組質(zhì)粒DNA濃度的最低檢測核酸濃度Hps 38 pg／mL，App 3.8pg／mL，與單項PCR檢測靈敏度基本相符（圖4）。

2.4.2 最低檢測細(xì)菌含量 雙重PCR方法對Hps和App最低檢測細(xì)菌含量 Hps 8.9cfu，App 26.9 cfu，與單項PCR檢測靈敏度基本相符（圖5）。

2.5 通用性檢測結(jié)果

該方法對Hps 15個血清型參考菌株，100株Hps臨床分離株，App 12個血清型參考菌株和15株App臨床分離株的檢測結(jié)果表明，該方法能對標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離株全部檢出，表明該方法具有較好的通用性。

2.6 臨床樣本檢測結(jié)果

對36份臨床采集的疑似病料分別進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR檢測，常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)檢出Hps 13份，檢出率為36.11%；雙重PCR檢測出Hps 18份，檢出率為50%，未檢出App；單項PCR檢測與雙重PCR檢測結(jié)果一致。

2.7 人工感染樣本的檢測結(jié)果

在Hps人工感染試驗中，肺臟組織用單項PCR和雙重PCR檢測，結(jié)果均為Hps陽性；在App人工感染試驗中，肺臟組織用單項PCR和雙重PCR檢測，結(jié)果均為App陽性。

圖4 雙重PCR最低檢測核酸濃度Fig.4 Minimal detection concentration of nucleic acids in the duplex PCR

圖5 雙重PCR最低檢測細(xì)菌含量Fig.5 Minimal detection of cfu in duplex PCR

3 討論

Hps和App是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原菌，而且兩種病原菌均為革蘭陰性菌，具有多形性，生長條件要求嚴(yán)格，難于培養(yǎng)和分離，給診斷和治療帶來一定的困難，因此需要建立一種快速檢測方法。多重PCR檢測技術(shù)是一種快速、特異、敏感和可靠的病原檢測方法［4－6］。16SrRNA 基因普遍存在于細(xì)菌并參與細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成過程，已成為細(xì)菌分類和鑒定的一個重要標(biāo)志，目前已經(jīng)建立了多種細(xì)菌基于16SrRNA 基因的分子診斷方法［9－10］。溶血素（Apx）為App毒力因子之一，屬于RTX毒素家族，ApxIVA由Schaller A等于1999年在App中首次發(fā)現(xiàn)，存在于所有血清型的放線桿菌中，具有種的特異性［11－12］。本研究參考已發(fā)表的針對 Hps 16S rRNA引物及App ApxIVA設(shè)計的引物，擴(kuò)增出822bp及346bp的目的片段，所建立的雙重PCR對其他細(xì)菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，表明建立的方法具有較好的特異性，最低可檢測核酸濃度Hps 38 pg／mL，App 3.8pg／mL；最低檢測細(xì)菌含量 Hps 8.9cfu，App26.9cfu，與單項PCR的敏感性一致。

該方法通用性研究表明，應(yīng)用該方法對Hps 15個血清型參考株，100株臨床分離株均能檢出；對App 12個血清型參考株，15株臨床分離株均能檢出，說明該方法具有良好的通用性。對常規(guī)的細(xì)菌分離培養(yǎng)及該雙重PCR方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示該方法對Hps和App的檢出率明顯高于常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)；而且該方法特異性和敏感性高、操作簡便、快速高效，可在5h內(nèi)檢測出結(jié)果。因此，本研究建立的Hps和App雙重PCR檢測方法對于Hps和App感染的快速診斷及病原的監(jiān)測等均具有很高的實用價值。

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