非洲馬瘟病毒實時熒光定量RT－PCR 檢測方法的建立

趙文華，楊仕標，李富祥

（云南省畜牧獸醫(yī)科學院 國家外來動物疫病診斷實驗室 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明650224）

非洲馬瘟（African horse sickness，AHS）是由呼腸病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Orbivirus）的非洲馬瘟病毒（AHSV）引起的感染所有馬科動物的一種非接觸性病毒性傳染病。本病以呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)的病理變化為特征，目前發(fā)現(xiàn)至少有2種庫蠓屬昆蟲可傳播該病，至少存在9個血清型。AHS在非洲的撒哈拉地區(qū)呈地方性流行，也曾在非洲北部、中東、歐洲發(fā)生，該病的發(fā)生呈季節(jié)性。易感動物感染后的病死率最高可達95%，一旦暴發(fā)會給養(yǎng)馬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，因此世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須通報的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病［1－2］。

鑒于該病的嚴重性和對養(yǎng)馬業(yè)的毀滅性打擊，在國家及國際間流動的馬匹必須要進行嚴格的動物檢疫，尤其是在地方流行區(qū)及無該疫病區(qū)域之間流動的馬匹更應該進行該病的檢疫。國際賽馬活動的普及以及馬胚質(zhì)資源的流動，邊境地區(qū)非法走私馬匹活動的存在，全球氣候變暖引發(fā)生態(tài)系統(tǒng)改變進而使病原微生物生態(tài)變化等，種種因素皆可能造成AHS在非地方流行區(qū)域的暴發(fā)流行［3］。我國目前雖為AHS無疫區(qū)，但隨時面臨該外來病被引入的風險，因此有必要對該類外來動物疫病進行相應檢測、監(jiān)測技術(shù)的貯備。本研究在已建立AHSV群、型特異 RT－PCR 檢 測 方 法 的 基 礎(chǔ) 上［4－5］，選 擇 保 守 的VP7蛋白基因S7區(qū)段設(shè)計一對特異性引物，用實時熒光定量RT－PCR方法對AHSV的快速定性和定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清及病毒 AHSV 9個血清型的滅活凍干疫苗均由 Onderstepoort（South Africa）引進，詳細情況如表1所示。藍舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）為本實驗室保存，鹿流行性出血癥病毒（Epizootic hemorrhagic disease virus of deer，EHDV）RNA為云南省出入境檢驗檢疫局提供，凍存的正常馬淋巴組織為哈爾濱畜牧獸醫(yī)科學研究所饋贈。

1.1.2 試劑、耗材及儀器 TaKaRa MiniBest Viral RNA／DNA Extraction kit用于病毒RNA的抽提，One step SYBR Primescript RT－PCR kit 用 于SYBR熒光定量RT－PCR，Goldview核酸染色劑均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；熒光定量PCR反應管及ABI 7500Fast熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品；Blowest Agarose為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；氯仿、異丙醇、無水乙醇等其他試劑均為分析純試劑。

表1 所引進AHSV 9個血清型情況表Table 1 The status of 9serotypes of AHSV

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù)GenBank及作者所測序列，設(shè)計特異性引物對。引物情況如下表2所示，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，為HPLC級別。將合成的引物干粉用無RNase酶的PCR級水進行溶解，引物貯存濃度為100pmol／μL，工作濃度為20.0pmol／μL。

表2 SYBR GreenⅠ熒光定量RT－PCR引物Table 2 The primers for SYBR Green I real－time RT－PCR

1.2.2 病毒基因組RNA提取 按照RNA提取試劑盒說明書操作，簡述如下：先用滅菌水按要求溶解非洲馬瘟滅活疫苗凍干粉，然后取200μL待用。取200μL已制備好的樣本，加入1.5mL離心管中，然后加入200μL的Solution A，劇烈振蕩混勻后，室溫放置5min，再加入75μL的Solution B，混合均勻后，12 000r／min離心5min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的2mL收集管中，加入250μL含10mL／L冰乙酸的異丙醇，上下顛倒混勻，然后將上清液轉(zhuǎn)移至安置在另一新的2mL收集管中的吸附柱中，12 000 r／min離心1min，棄濾液。將500μL的Rinse A加入至上述吸附柱中，室溫靜置1min，12 000 r／min離心1min，棄濾液。再將800μL的Rinse B加入至上述吸附柱中，1 200r／min離心1min，棄濾液，再次進行12 000r／min離心1min。最后將吸附柱安置于一新的1.5mL的離心管上，在吸附柱膜的中央處加入50μL的含20mL／L的RNase Inhibitor的Elution buffer，室溫靜置3min～5min，然后12 000r／min離心2min洗脫RNA。棄吸附柱，將收集有RNA液體的離心管，貯存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 熒光定量RT－PCR反應液的配制及反應條件的設(shè)置 分別采用未預變性法及預變性法。未預變性法反應液各組分的配制為：2×One step SYBR buffer 10.0μL，Enzyme mix 2 0.8μL，Primer SYBR－2F／2R各0.2μL，RoxⅡ0.4μL，RNA 2.0 μL，H2O 6.4μL。預變性法變性部分反應液配制為：Primer SYBR－2F／2R各0.2μL，RNA 2.0μL，H2O 5.6μL；變性后需再加入的反應成分為：2×One step SYBR buffer 10.0μL，Enzyme mix2 0.8 μL，RoxⅡ0.4μL，H2O 0.8μL。質(zhì)粒標準品反應液配制為：2×One step SYBR buffer 10.0μL，Enzyme mix 2 0.8μL，Primer SYBR－2F／2R各0.2 μL，RoxⅡ0.4μL，plasmid DNA 1.0μL，H2O 7.4 μL。

未預變性法反應程序為：42℃10min，95℃2 min，然后采用二步法熒光定量PCR反應或者三步法反應，即40×（95℃5s，60℃30s）或者40×（95℃5s，57℃45s，81℃30s），二步法在60℃反應步驟收集熒光信號，三步法在81℃反應步驟收集熒光信號，二者均在60℃～95℃之間做熔解曲線。預變性法反應程序為：先將預變性部分97℃變性6min，立即冰浴3min，然后再加入其他組分按照未預變性法反應程序進行反應。質(zhì)粒標準品反應按未預變性法進行。

1.2.4 實時熒光定量RT－PCR特異性試驗 除對9個血清型的AHSV RNA進行熒光定量檢測外，還對同屬的BTV、EDHV及正常馬組織進行鑒別檢測，以驗證SYBR Green引物對對AHSV的特異性。

1.2.5 標準曲線的建立及敏感性、重復性試驗 10倍系列稀釋本實驗室已構(gòu)建好的AHSV 9型pMD－18T－VP7質(zhì)粒，進行SYBR－2F／2R引物對質(zhì)粒標準品標準曲線的構(gòu)建及檢測敏感性確定。選取107、106、105、104、103拷貝／μL 的質(zhì)粒標準品分別重復擴增3次，進行重復性試驗。

2 結(jié) 果

2.1 普通電泳對RT－PCR擴增結(jié)果的檢測

RT－PCR結(jié)束后，用20g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況（圖1）。從普通電泳結(jié)果可看出引物SYBR－2F／2R僅對9個血清型的AHSV RNA有特異性擴增，擴增片段與預期的184bp片段相符，而對BTV、EDHV、正常馬淋巴組織及陰性對照均無擴增。

2.2 熒光定量特異性擴增及熔解曲線分析

經(jīng)條件優(yōu)化后，引物對SYBR－2F／2R僅對9個血清型的AHSV RNA有特異曲線出現(xiàn)，而對BTV、EDHV、正常馬組織及陰性對照均無熒光信號檢出。經(jīng)反應后做熔解曲線分析，每型AHSV均有單一特異性峰出現(xiàn)，而未檢出熒光信號的BTV、EDHV、正常馬淋巴組織及陰性對照熔解曲線均為多峰，且較陽性樣品Tm值低（圖2和圖3）。

圖1 樣本普通PCR擴增電泳圖Fig.1 The electrophoresis of routine RT－PCR for samples

圖2 樣本實時熒光定量RT－PCR特異性熒光擴增Fig.2 Amplification plot of SYBR Green Ⅰ real－time RT－PCR for samples

2.3 SYBR Green I RT－PCR最優(yōu)反應條件

經(jīng)多次摸索，最后確定引物對SYBR－2F／2R對AHSV的最佳反應條件為：預變性加三步PCR法，即按方法1.2.3配制好預變性液，97℃6min，后立即將反應管置冰浴中3min，然后再加入按方法1.2.3配制好的其他反應液成分，進行RT－PCR反應。最佳SYBR Green I熒光定量RT－PCR反應條件為：42℃10min，95℃2min，40個循環(huán)；95℃5s，57℃45s，81℃30s；最后進行熔解曲線的特異性分析。依據(jù)多次反應熔解曲線的結(jié)果確定81℃進行熒光信號的收集，而非常規(guī)的60℃。這樣可有效消除引物二聚體對檢測結(jié)果的干擾。

2.4 標準曲線的建立及敏感性、重復性試驗

以本實驗室已經(jīng)構(gòu)建好的AHSV血清9型pMD18－T－VP7質(zhì)粒為標準品，制備108拷貝／μL至101拷貝／μL的10倍系列稀釋品，用SYBR－2F／2R引物對標準品按照最優(yōu)反應條件進行擴增，根據(jù)擴增曲線構(gòu)建標準曲線。反應后熔解曲線顯示不同稀釋度的標準品均有單一特異峰（圖4），熔解溫度為82.05℃±0.15℃；待樣品濃度降低至接近零時，出現(xiàn)熔解溫度低于樣品峰的引物二聚體峰。擴增曲線結(jié)果顯示在107拷貝／μL至103拷貝／μL濃度之間標準品質(zhì)粒濃度的對數(shù)與Ct值之間存在良好的線性關(guān)系，標準曲線的方程式為：Y＝－3.254 493X＋37.112 000，R2＝0.994 392，其中 Y為Ct值，X為拷貝數(shù)的對數(shù)（Log copy number），R2為相關(guān)系數(shù)，擴增效率可達102.89%（圖5）。

敏感性試驗結(jié)果顯示，SYBR－2F／2R引物對樣本的檢測敏感性為102拷貝／μL（圖6）；而用引物進行普通PCR檢測時檢測敏感度僅為103拷貝／μL（圖7），實時熒光定量RT－PCR法要較之敏感10倍。選取107、106、105、104、103copies／μL的標準模板以優(yōu)化的反應條件分別連續(xù)擴增3次，結(jié)果顯示每個梯度的樣本重復性很好。檢測結(jié)果的統(tǒng)計學分析表明，組內(nèi)重復性試驗變異系數(shù)均小于2.5%，說明該方法具有較好的重復性與穩(wěn)定性（表3）。

圖3 樣本熒光定量RT－PCR熔解曲線Fig.3 Melting curves of SYBR real－time RT－PCR for samples

圖4 標準品熔解曲線Fig.4 Melting curves of the standard plasmids

圖5 SYBR GreenⅠ 實時熒光定量RT－PCR標準曲線Fig.5 Standard curve of the SYBR GreenⅠreal－time PCR

圖6 SYBR GreenⅠ 實時熒光定量RT－PCR敏感性擴增曲線Fig.6 Sensitive test of the SYBR real－time PCR

圖7 普通PCR敏感性試驗Fig.7 Sensitive test of the routine PCR

3 討 論

目前，AHSV感染主要通過血清學和病毒分離的方式進行診斷、鑒定［6］。血清學在鑒定是否以前存在感染的流行病學方面是很有用的，常用的試驗方法有瓊脂擴散試驗（Agar Gel Immunodiffusion，AGID）、競爭 ELISA（c－ELISA）等。病毒分離和病毒中和試驗可最終確定AHSV感染［7］。但上述方法均需花費很長時間，不適于AHSV的快速確診。而分子生物學診斷技術(shù)RT－PCR方法可實現(xiàn)對RNA病毒的快速檢測，實時熒光定量RT－PCR（Real－time RT－PCR）則是在常規(guī) RT－PCR方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種更為敏感、快速的檢測方法。本試驗是基于AHSV基因組S7片段設(shè)計一對特異引物，建立AHSV染料法（SYBR GreenⅠ）實時熒光定量RT－PCR快速檢測方法。本研究所建立的方法可對引進的AHSV 9個血清型的滅活疫苗毒RNA進行很好地檢測，但尚需大量的臨床樣本進行驗證。鑒于我國目前尚無非洲馬瘟的發(fā)生，從生物安全方面考慮，不能引進AHSV的病料，若有可能應該前往AHSV地方流行國家和地區(qū)進行臨床驗證。但本研究所建立的方法卻不失為應對AHSV外來病挑戰(zhàn)的一種有用的技術(shù)貯備。

表3 SYBR GreenⅠ 實時熒光定量PCR的重復性試驗Table 3 Repeatability test of SYBR Green Ⅰ real－time PCR

SYBR GreenⅠ是一種雙鏈DNA結(jié)合染料，能特異性地結(jié)合到DNA雙鏈的小溝中。游離的SYBR greenⅠ基本沒有熒光信號，但結(jié)合雙鏈DNA后，它的熒光信號可成百倍的增加。用SYBR greenⅠ進行實時熒光定量RT－PCR時，只要有合適的引物和模板，即可實現(xiàn)任何目的基因的實時定量。另外，SYBR greenⅠ的價格比較便宜，所以SYBR greenⅠ實時定量RT－PCR是十分值得推薦的技術(shù)。但是，SYBR greenⅠ對雙鏈DNA的結(jié)合是非特異性的，RT－PCR中的非特異性擴增產(chǎn)物，特別是引物二聚體（Primer－dimers，PDs），也會產(chǎn)生熒光信號并嚴重干擾對目的基因的測定［8］。

一般情況下，進行熒光PCR反應時，均采用兩步法，但就SYBR GreenⅠ而言，因其“特異”性檢測熒光信號的缺陷，采用兩步法很容易因引物二聚體的干擾而產(chǎn)生假陽性的結(jié)果［9］。而根據(jù)對反應產(chǎn)物熔解曲線的分析，設(shè)定另一高于引物二聚體Tm值而低于特異擴增產(chǎn)物Tm值的溫度，進行熒光信號的收集則可有效的消除引物二聚體對正常特異擴增結(jié)果的干擾。本試驗即采用此方法，通過前期條件的摸索及熔解曲線的分析，最終確定適合所設(shè)計引物的“三步法”SYBR GreenⅠ實時定量PCR方法。當然通過三步法，在較高溫度進行熒光信號收集時，使引物二聚體解鏈，可排除非特異干擾，但對正常特異熒光也會有部分的損失。因此，在最開始SYBR引物的設(shè)計中，就應該特別注意所設(shè)計引物的Tm值，應該盡可能的增大引物二聚體與特異擴增產(chǎn)物之間的Tm值，以利于“三步法”的實施。

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