LY-294002對大鼠急性脊髓損傷后Bcl-2表達的影響

王巖峰 秦光華 楊明超 王 喆 (中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，遼寧 沈陽 110001)

Bcl-2抑制細胞凋亡基因機制為:①抑制內質網(wǎng)Ca2+的釋放;②Bcl-2阻止促凋亡基因信號傳遞或阻止誘導某些基因表達;③抑制自由基。潘磊等〔1〕對60只Wistar成年大鼠研究發(fā)現(xiàn)，實驗組Bcl-2蛋白不僅在神經(jīng)元中提高表達，更多在膠質細胞中表達，同時降低Bax的表達，BBB評分表明，神經(jīng)細胞凋亡明顯減少，大鼠神經(jīng)功能恢復明顯。國外有學者證實毫微粒MP療法能減少副作用，增強急性脊髓損傷(SCI)功能恢復，其機制之一仍為提高 Bcl-2表達和抑制 Bax表達〔2〕，但是 LY-294002是否能夠提高SCI大鼠脊髓損傷部位Bcl-2的表達尚不清楚。本實驗參照Nystrom壓迫方法制作大鼠脊髓壓迫損傷模型，通過免疫組化和Western印跡方法檢測不同時間點Bcl-2的表達情況，探討PI3K/Akt信號通路在SCI的病理作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 羊抗大鼠Bcl-2多克隆抗體(Santa-Cruz，CA);PI3K阻斷劑(LY-294002)，兔抗羊IgG、S-P免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(福州邁新)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠SCI動物模型的建立及分組 取健康成熟SD大鼠104只，雌雄不限，體重220～250 g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。隨機分為:SCI組:脊髓損傷后分2 h，8 h，1 d，3 d，5 d，7 d共個6時間點，每個時間點8只;LY294002組:脊髓損傷前 0.5 h 尾靜脈注射 LY-294002，分為 2 h，8 h，1 d，3 d，5 d，7 d共6個時間點，每個時間點8只，空白對照組8只，不做任何處理。模型制備:10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔內注射，俯臥位固定，無菌原則下進行背正中切口，切除T8、T9椎板，暴露硬脊膜，整個過程保證硬脊膜的完整。按Nystrom法將35 g重物通過2.2 mm×5 mm弧形光滑金屬墊片壓迫該段脊髓后正中部5 min，分層縫合，碘伏消毒。損傷后，每天人工排尿(便)兩次，局部消毒一次。

1.2.2 取材及切片制備 各組大鼠分別于脊髓損傷后各時間點取材，麻醉后剖胸，經(jīng)左心室-主動脈插管，4%多聚甲醛灌流固定。以傷處為中心取1.5 cm脊髓組織，多聚甲醛浸泡固定。常規(guī)蠟塊包埋，連續(xù)切片數(shù)張(縱切)，片厚6 μm。

1.2.3 免疫組化 每只大鼠取12張切片，按SP試劑盒說明書測定Bcl-2的表達，常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫處理、高溫修復、血清封閉、滴加一抗過夜(濃度為1∶150)，并同時用PBS代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜、隔日滴加二抗孵育20 min、SABC 37℃孵育20 min，繼而DAB顯色，鏡下觀察顯色背景。以上各步驟間均用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察脊髓組織變化。

1.2.4 Western印跡 動物以10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔內注射，麻醉后，各時間點分別取4只動物，直視下取出距損傷中心區(qū)上下各0.5 cm兩段脊髓，置于裂解液中機械勻漿，4℃ 17 000 r/min離心1 h，取上清，測蛋白濃度并計算加樣量。制備12%分離膠，4%濃縮膠，用微量加樣器將樣品加在凝膠表面樣品槽中。電泳后濕轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉TTBS緩沖液4℃過夜。一抗Bcl-2、β-actin(1∶200)室溫孵育2 h，洗膜，辣根酶標記羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000，Santa Cruz)室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑(Santa Cruz)反應1 min，暗室曝光顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析，測得目標帶的MOD，進而計算出各組樣品Bcl-2目標帶的MOD與內參照βactin MOD的比值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果用±s表示，各組比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果 免疫組化結果發(fā)現(xiàn)，假手術組大鼠脊髓有大量的Bcl-2陽性表達的神經(jīng)細胞(0.71±0.04);而在脊髓損傷后2 h時，Bcl-2陽性細胞數(shù)已開始明顯減少，在3 d時Bcl-2陽性表達細胞數(shù)最少，5 d時Bcl-2陽性表達細胞數(shù)開始增加。在經(jīng)LY-294002處理后的各時間點大鼠脊髓損傷部位的Bcl-2陽性細胞明顯高于相同時間點的脊髓損傷組大鼠(P＜0.05)。顯微圖像分析統(tǒng)計光密度值是也得到了相同的結論，光密度值比較，見圖1，表1。

2.2 Western印跡結果 從Western印跡電泳結果上可以看出，假手術組大鼠脊髓部位的Bcl-2的蛋白條帶清晰(0.54±0.04)，而在脊髓損傷后2 h的Bcl-2的蛋白條帶顏色已開始變淺變細，表達量開始減少，到3 d時，蛋白表達的條帶最淺，5 d時表達開始逐漸增多，在經(jīng)LY-294002處理后的各時間點大鼠脊髓損傷部位的Bcl-2蛋白表達則明顯高于相同時間點的脊髓損傷組大鼠(P＜0.05)，見圖2，表2。

表1 各組大鼠的Bcl-2蛋白的光密度值比較(± s，n=8)

表1 各組大鼠的Bcl-2蛋白的光密度值比較(± s，n=8)

與SCI組比較:1)P＜0.05，下表同

組別2 h 8 h 24 h 3 d 5 d 7 d SCI組 0.58±0.06 0.51±0.07 0.46±0.07 0.32±0.06 0.41±0.06 0.55±0.07 LY294002組 0.64±0.071) 0.56±0.071) 0.50±0.061) 0.42±0.061) 0.48±0.071) 0.61±0.071)

表2 各組大鼠的Bcl-2/β-actin的光密度值比較(± s，n=8)

表2 各組大鼠的Bcl-2/β-actin的光密度值比較(± s，n=8)

組別2 h 8 h 24 h 3 d 5 d 7 d SCI組 0.43±0.04 0.41±0.05 0.38±0.04 0.31±0.04 0.34±0.04 0.40±0.02 LY294002組 0.49±0.051) 0.46±0.041) 0.42±0.021) 0.40±0.021) 0.42±0.021) 0.43±0.021)

圖1 免疫組化方法檢測Bcl-2蛋白的表達(×400)

圖2 Western印跡方法檢測Bcl-2和β-actin蛋白的表達

3 討論

SCI為臨床常見的嚴重創(chuàng)傷，因高致殘率和高病死率一直成為醫(yī)學研究的熱點。SCI包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷不可逆，無法對其進行有效的治療。繼發(fā)性損傷是指傷后幾小時至幾天脊髓損傷局部原來正常的組織發(fā)生自身破壞性病變，其造成的損害超過原發(fā)性損傷〔3～5〕，研究證實，脊髓繼發(fā)性損傷廣泛存在著細胞凋亡現(xiàn)象〔6〕。

細胞凋亡受多種凋亡相關基因及其蛋白的調控，其中Bcl-2基因家族及其相關蛋白在細胞凋亡的調控過程中具有重要作用〔7〕，Bcl-2主要位于線粒體外膜、核被膜和內質網(wǎng)膜，可抑制細胞凋亡基因，有研究證實，β-七葉皂甙鈉改善血循環(huán)，中止SCI繼發(fā)性損傷，抑制脊髓神經(jīng)細胞凋亡和炎癥表達的機制之一是上調Bcl-2表達〔8〕，還有研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物(EGb)能抑制SCI后細胞凋亡，在運動功能恢復、損傷脊髓組織保護上發(fā)揮其有益作用，其機制之一也是上調Bcl-2和下調Bax基因表達〔9，10〕。磷脂酰肌醇(-3)激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信號通路是體內非常重要的一個信號通路，能夠調節(jié)細胞凋亡、葡萄糖代謝及蛋白質合成等過程。LY-294002是PI3K的特異性抑制劑，能夠抑制PI3K的表達，阻斷PI3K/Akt信號傳導通路。但是，LY-294002是否能夠通過阻斷PI3K/Akt信號傳導通路繼而降低Bcl-2的表達參與脊髓損傷尚不清楚，這也是本實驗研究的目的。本研究說明LY294002能夠通過阻斷PI3K/Akt信號傳導通路繼而降低Bcl-2的表達。

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