絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路抑制劑對斷奶仔豬小腸形態(tài)和腸通透性的影響

欒兆雙 宋 娟 胡彩虹

(浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，動(dòng)物分子營養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058)

腸道是機(jī)體與外界環(huán)境接觸最為密切的部位，不僅是消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要場所，而且是機(jī)體的重要免疫屏障。腸道損傷所涉及的缺血、炎癥、凋亡等多個(gè)病理機(jī)制與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)道路的調(diào)節(jié)有關(guān)。MAPK信號(hào)通路是廣泛存在于真核生物中保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，MAPK被激活后可停留在胞質(zhì)中，激活一系列其他蛋白激酶，亦可進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)，完成對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)。MAPK參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡、對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理/病理過程[1-3]。目前已在哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆和鑒定了4個(gè)MAPK亞族:胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2(external-signal regulated kinase，ERK1/2)、c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38 MAPK和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)。Broom 等[2]報(bào)道，炎癥性腸疾病引起ERK1/2、p38 MAPK被激活，MAPK激活時(shí)間、程度與腸損傷時(shí)間、程度一致。大量研究表明，斷奶應(yīng)激使仔豬腸形態(tài)受損，消化吸收能力下降[4]，并且使仔豬腸道的通透性增加，破壞腸屏障功能[5-6]。然而關(guān)于早期斷奶應(yīng)激引起仔豬腸道損傷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚[7]。MAPK是否參與此過程目前尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過MAPK信號(hào)通路抑制劑預(yù)處理斷奶仔豬，旨在研究阻斷p38 MAPK、JNK和ERK信號(hào)通路對斷奶仔豬小腸形態(tài)和腸通透性的影響，為防治仔豬早期斷奶應(yīng)激引起的腸道損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用體重約為5.8 kg的24頭21日齡杜×長×大斷奶仔豬，隨機(jī)分成4組，每組6頭。試驗(yàn)組斷奶前30 min分別腹腔注射p38 MAPK抑制劑(2 mg/kg SB203580，Ⅰ組)、JNK 抑制劑(4 mg/kg SP600125，Ⅱ組)和 ERK1/2抑制劑(2 mg/kg PD98059，Ⅲ組)，對照組注射等量的生理鹽水。仔豬自由采食和飲水，按常規(guī)程序進(jìn)行管理。于斷奶后36 h屠宰仔豬取樣待測。

1.2 飼糧及營養(yǎng)水平

基礎(chǔ)飼糧參照美國NRC(1998)斷奶仔豬的營養(yǎng)需要配合成顆粒飼料。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 樣品采集與測定

仔豬早晨空腹前腔靜脈取血，肝素抗凝，制備血漿，-80℃保存。屠宰后，沿腸系膜縱向切開小腸，取空腸中段長度約1 cm的腸管，浸入10%福爾馬林固定液中4℃保存。另取10 cm左右空腸用剪刀剖開，用生理鹽水輕輕沖洗腸內(nèi)容物，用濾紙吸干水分，再用手術(shù)刀鈍面輕輕刮取腸黏膜，分裝在5 mL無菌凍存管中，液氮速凍，-80℃保存。

1.3.1 小腸形態(tài)分析

用一系列濃度梯度的乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片。Leica Qwin圖像分析儀測定絨毛高度和隱窩深度。

1.3.2 腸通透性

血漿D-乳酸含量測定參照Brandt等[8]建立的分光光度法。血漿二胺氧化酶(DAO)含量用豬DAO ELISA試劑盒(Uscn Life Science公司，美國)測定。

1.3.3 小腸黏膜促炎細(xì)胞因子水平

稱取一定量黏膜，按1∶9加入磷酸鹽緩沖液，勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，制備成10%的黏膜勻漿液，促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素 1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素 6(IL-6)和干擾素γ(IFN-γ)水平采用ELISA試劑盒(R＆D System，美國)測定。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) %

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)計(jì)算程序采用SAS 6.12中的一般線性模型(general linear models)進(jìn)行，平均值的比較采用Duncan氏法進(jìn)行，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 空腸形態(tài)

由表2可知，Ⅰ組絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度均高于對照組(P＜0.05)，隱窩深度顯著低于對照組(P＜0.05);與對照組相比，Ⅱ組絨毛高度/隱窩深度顯著提高(P＜0.05)，而Ⅲ組各指標(biāo)均未顯著變化(P＞0.05)。

表2 不同MAPK通路抑制劑對斷奶仔豬空腸形態(tài)的影響Table2 Effects of different inhibitors of MAPK pathways on jejunal morphology of weaner piglets

2.2 腸通透性

由表3可知，與對照組相比，Ⅰ組和Ⅱ組仔豬血漿D-乳酸、DAO含量顯著降低(P＜0.05)，Ⅰ組降低程度較大，而Ⅲ組仔豬血漿D-乳酸含量顯著升高(P＜0.05)。

表3 不同MAPK通路抑制劑對斷奶仔豬腸通透性的影響Table3 Effects of different inhibitors of MAPK pathways on intestinal permeability of weaner piglets

2.3 空腸黏膜細(xì)胞因子

由表4可知，Ⅰ組空腸黏膜促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IFN-γ 水平顯著低于對照組(P＜0.05);與對照組相比，Ⅱ組TNF-α和 IL-1β水平顯著降低(P＜0.05)，IL-6和IFN-γ水平均未顯著變化(P＞0.05)，而Ⅲ組TNF-α水平顯著升高(P＜0.05)，IL-6和IFN-γ水平有上升的趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)。

表4 不同MAPK通路抑制劑對斷奶仔豬空腸黏膜促炎細(xì)胞因子的影響Table4 Effects of different inhibitors of MAPK pathways on jejunum mucosal pro-inflammatory cytokines of weaner piglets pg/mg prot

3 討論

MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的匯聚點(diǎn)，包括蛋白激酶C、離子通道等，它介導(dǎo)了細(xì)胞的生長、發(fā)育、分裂、死亡以及細(xì)胞間的功能同步等多種細(xì)胞生理過程。p38 MAPK和JNK均是應(yīng)激激活的MAPK，能被炎癥、應(yīng)激、損傷等信號(hào)激活[1-2，10]。p38 MAPK 和 JNK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

D-乳酸是胃腸道固有細(xì)菌的代謝終產(chǎn)物，哺乳動(dòng)物體內(nèi)不具備將其快速代謝分解的酶系統(tǒng)，因而血漿中D-乳酸含量的增加可反映腸通透性的改變。DAO是哺乳動(dòng)物腸絨毛上皮細(xì)胞的標(biāo)記酶，其活性與絨毛高度和黏膜細(xì)胞的核酸和蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)，可作為反映腸黏膜屏障功能損傷的理想指標(biāo)[9]。早期斷奶應(yīng)激會(huì)引起仔豬腸形態(tài)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為絨毛高度下降，隱窩深度加深，腸絨毛上成熟細(xì)胞數(shù)量減少，且黏膜的消化酶活性下降[11-12]，從而造成仔豬腸道消化吸收面積減少，消化能力下降，使仔豬腸道屏障功能受損[4，13-14]。前期作者研究了早期斷奶對仔豬腸黏膜屏障變化以及p38 MAPK信號(hào)通路的影響，結(jié)果表明，與哺乳組相比，21日齡仔豬斷奶后24和48 h小腸形態(tài)和黏膜屏障受損，斷奶應(yīng)激激活了p38 MAPK信號(hào)通路[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，斷奶前腹腔注射p38 MAPK和JNK抑制劑，仔豬小腸形態(tài)得到明顯的改善，腸道通透性顯著降低(血漿 D-乳酸、DAO含量顯著降低)，p38 MAPK抑制劑效果較明顯。p38 MAPK能激活細(xì)胞內(nèi)一些蛋白激酶，進(jìn)而激活低分子質(zhì)量熱休克蛋白27(HSP27)，介導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)以及促進(jìn)腸損傷后上皮細(xì)胞存活、增殖和修復(fù)過程[1]。本試驗(yàn)中p38 MAPK抑制劑處理后有較好的腸道改善效果可能與此有關(guān)。

細(xì)胞因子在腸黏膜免疫應(yīng)答中起重要作用，而且還參與維持上皮組織的完整性。斷奶因飼糧和環(huán)境的突然變化而產(chǎn)生的應(yīng)激引起仔豬腸道細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)發(fā)生改變，以適應(yīng)腸道在形態(tài)學(xué)和功能上的變化。Pie等[16]研究發(fā)現(xiàn)，28日齡斷奶使仔豬腸黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生早期的、暫時(shí)性的炎癥應(yīng)答，在小腸中部，TNF-α、IL-1β 和 IL-6 mRNA 等表達(dá)水平在斷奶后的前2天內(nèi)迅速增加，隨后恢復(fù)到斷奶前水平。p38 MAPK的激活與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，調(diào)節(jié)多種炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)，調(diào)控炎癥反應(yīng)[17]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，斷奶前腹腔注射p38 MAPK和JNK抑制劑仔豬小腸促炎細(xì)胞因子表達(dá)量顯著降低，p38 MAPK抑制劑效果較明顯。Mihaescu 等[18]報(bào)道，ERK1/2、JNK、p38 MAPK參與輻射導(dǎo)致的腸黏膜損傷，用特異性p38 MAPK抑制劑SB203580抑制p38 MAPK活性，可明顯減少TNF-α釋放，減輕腸黏膜組織損傷。還有學(xué)者利用Caco-2、T84等細(xì)胞模型，研究了促炎因子TNF-α、IFN-γ等對腸通透性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)促炎因子可通過改變腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的基因表達(dá)和分布，破壞緊密連接，進(jìn)而增加腸道通透性[19]。提示用p38 MAPK和JNK抑制劑抑制信號(hào)通路，可能通過抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕仔豬腸道炎癥，從而保護(hù)腸黏膜屏障。其中具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

ERK1/2通路在促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增生和分化中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，斷奶前注射ERK1/2抑制劑仔豬腸屏障沒有得到改善，反而有加重?fù)p傷的趨勢。Basuroy等[20]在研究過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白重新分布，細(xì)胞骨架被破壞，細(xì)胞通透性增加，而上皮生長因子可以通過激活ERK1/2通路保護(hù)緊密連接蛋白，保護(hù)腸黏膜;用ERK1/2抑制劑處理后，上皮生長因子的保護(hù)作用被阻斷。ERK1/2信號(hào)通路在小腸損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用[21]。提示在斷奶應(yīng)激致仔豬腸屏障損傷過程中ERK信號(hào)通路的激活可能起到一定的修復(fù)保護(hù)作用。

4 結(jié)論

在斷奶應(yīng)激致仔豬小腸黏膜屏障受損過程中，抑制p38 MAPK和JNK通路后，腸屏障得到改善，而抑制ERK1/2通路后腸屏障損傷有加重的趨勢。

致謝:

感謝美國北卡羅琳娜州立大學(xué)(North Carolina State University)獸醫(yī)學(xué)院Moeser博士對本試驗(yàn)選題、構(gòu)思和論文撰寫給予的指導(dǎo)。

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