一株產(chǎn)堿菌聯(lián)合蜈蚣草對(duì)Pb污染土壤的生物修復(fù)

金 羽，曲娟娟，朱 超，閆立龍，孫興濱，李建政

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，哈爾濱 150090；3.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

土壤是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)，是環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分。我國(guó)土壤污染形勢(shì)嚴(yán)峻，其中重金屬的污染問(wèn)題日益突出，土壤生態(tài)環(huán)境受到影響，損失大量可利用土地[1-2]。資料表明，汽車尾氣排放、農(nóng)藥施用、生活垃圾的處理、采礦及冶煉過(guò)程等釋放大量Pb元素，土壤Pb污染最為普遍[3]。土壤重金屬污染的預(yù)防和修復(fù)成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而土壤生物修復(fù)方法，具有投資少、修復(fù)徹底等優(yōu)勢(shì)[4]。

超富集植物以其高效的重金屬吸收能力而被廣泛關(guān)注，植物修復(fù)技術(shù)研究重心逐漸由篩選和發(fā)現(xiàn)超富集植物向提高其修復(fù)效率轉(zhuǎn)變[5-6]。細(xì)菌可以分泌有機(jī)酸、酶等物質(zhì)對(duì)土壤重金屬活化、植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。有盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株WS34（Burkholderia sp.）能明顯提高供試植物的生物量和Pb、Cd吸收量[7]。Chen等研究表明，向Cu污染土壤中接種MS3菌株能夠有效促進(jìn)植物對(duì)Cu吸收[8]。趙根成等利用向土壤中添加外源耐砷微生物促進(jìn)超富集植物蜈蚣草對(duì)砷的吸收[9]。本研究通過(guò)盆栽試驗(yàn)，在Pb處理土壤中栽植蜈蚣草，向土壤中接種耐Pb細(xì)菌（Alcaligenes sp.），通過(guò)對(duì)比接種組與對(duì)照組蜈蚣草植株P(guān)b含量以及土壤酶活性，探討接種耐鉛細(xì)菌Alcaligenes sp.對(duì)蜈蚣草吸收Pb影響。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站，采用常規(guī)方法測(cè)定其理化性質(zhì)[10]。供試植物為蜈蚣草，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供。供試菌株為本實(shí)驗(yàn)室自鉛鋅礦區(qū)土壤分離獲得的一株耐鉛產(chǎn)堿菌（Alcaligenes sp.）。

供試土壤理化性質(zhì)為：土壤顆粒密度（1.15±0.27）g·cm-3、土壤有機(jī)質(zhì)（4.48±0.64）g·kg-1、土壤鉛含量（46.0±3.84）mg·kg-1、pH（H2O）為 6.85±0.15。

1.2 方法

1.2.1 耐鉛菌株（Alcaligenes sp.）的培養(yǎng)

將菌株（Alcaligenes sp.）接種至細(xì)菌液體LB培養(yǎng)基中，30℃180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，用無(wú)菌水洗滌沉淀，重新懸浮后無(wú)菌水稀釋至108個(gè)·mL-1，待用。

1.2.2 土壤的處理

將采集土壤樣品過(guò)篩（篩孔3 mm），用Pb（NO3）2作為土壤Pb污染物，將其溶解至定量的水中，均勻噴灑到土樣上，混勻，控制土樣的Pb質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、100、200、400、600 mg·kg-1。

1.2.3 盆栽試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)在溫室下（25℃）進(jìn)行，每盆（3次重復(fù)）裝有Pb處理土壤2 kg，穩(wěn)定1周后移栽蜈蚣草植株（每盆5株），移栽成活后，均勻噴灑100 mL菌液到土壤表面，對(duì)照組噴灑等體積無(wú)菌水。

1.3 樣品采集及測(cè)定方法

1.3.1 植物樣品采集及分析

收獲時(shí)沿土壤平面剪下蜈蚣草土上部分，同時(shí)洗出根系，于105℃殺青30 min后在70℃下烘干至恒重。烘干樣品全部粉碎，采用混合酸法（HNO3-HClO4）消解，通過(guò)火焰原子吸收光譜儀（島津，AA-6300）測(cè)定Pb含量。

1.3.2 蜈蚣草葉綠素含量的測(cè)定

葉綠素含量采用丙酮-乙醇分光光度法[11]。

計(jì)算公式如下：Ca=13.95A665-6.88A649；Cb=24.96A649-7.32A665。據(jù)此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度（Ca、Cb：mg·L-1），二者之和為總?cè)~綠素的濃度。最后根據(jù)下式可進(jìn)一步求出植物組織中葉綠素的含量：

葉綠素的含量（mg·g-1）=[葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)]/樣品鮮重。

1.3.3 土壤酶活的測(cè)定

土壤樣品脲酶，磷酸酶，轉(zhuǎn)化酶及過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定，均采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[12]。脲酶活性以24 h后1 g干土中含NH3-N的mg數(shù)來(lái)表示；磷酸酶的活性以1 g土壤2 h產(chǎn)生的P2O5mg數(shù)表示；轉(zhuǎn)化酶活性以每5 g干土24 h生成葡萄糖的mg數(shù)表示；過(guò)氧化氫酶活性以1 g干土20 min內(nèi)消耗0.02 mol·L-1KMnO4的mL數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種耐鉛產(chǎn)堿菌對(duì)蜈蚣草吸收Pb的影響

圖1為不同土壤鉛濃度處理下蜈蚣草植株鉛含量變化情況，由圖1可見(jiàn)，隨著土壤Pb濃度由0增加至600 mg·kg-1，對(duì)照組及接種組蜈蚣草土上部分和土下部分的Pb含量均增加，且各處理濃度下，接種組的Pb含量明顯高于對(duì)照組。另外，無(wú)論對(duì)照組還是接種組的Pb含量均為土上部分高于土下部分。在土壤未噴灑Pb（NO3）2的情況下，接種組和對(duì)照組蜈蚣草土上部分的Pb含量分別為5.05和3.6 mg·kg-1；土下部分的Pb含量分別為3.49和3.26 mg·kg-1，可見(jiàn)，此條件下對(duì)照組和接種組的Pb含量相差不大，但土上部分Pb含量高于土下部分。在土壤Pb含量為600 mg·kg-1時(shí)，接種組和對(duì)照組蜈蚣草土上部分的Pb含量分別為82和42.4 mg·kg-1，接種組對(duì)Pb的吸收較對(duì)照組提高93.4%；接種組和對(duì)照組土下部分的Pb含量分別為44.35和27.36 mg·kg-1，接種組較對(duì)照組提高62.1%；接種組土上部分對(duì)Pb的吸收較土下部分高84.9%。由此可見(jiàn)，接種產(chǎn)堿菌顯著促進(jìn)蜈蚣草對(duì)土壤中Pb的吸收。

圖1 不同土壤鉛濃度處理下蜈蚣草植株鉛含量Fig.1 Lead content of Pteris vittatain different soil lead concentration

2.2 接種耐鉛產(chǎn)堿菌對(duì)蜈蚣草葉綠素含量的影響

葉綠素含量是反映光合強(qiáng)度的重要生理指標(biāo)，植物在受到環(huán)境因素?fù)p傷時(shí)，其正常的生理狀態(tài)遭到破壞，葉綠素含量呈下降趨勢(shì)，且其下降幅度反映了植物受脅迫損傷程度。謝明吉等研究顯示[13]，植株在重金屬脅迫下，重金屬進(jìn)入植株細(xì)胞后主要作用于葉綠素酯還原酶和膽色素原脫氫酶，從而導(dǎo)致葉片失綠，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降。試驗(yàn)結(jié)果表明，在重金屬Pb脅迫下蜈蚣草葉片葉綠素含量隨Pb含量增加而下降，這是因?yàn)楦邼舛茹U脅迫能導(dǎo)致葉綠體基粒結(jié)構(gòu)的解體及與片層結(jié)構(gòu)有關(guān)的基質(zhì)明顯減少，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)[14]；同時(shí)，由于Pb拮抗了植物對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)元素的吸收、轉(zhuǎn)移，阻斷了營(yíng)養(yǎng)元素向葉部運(yùn)輸，抑制合成葉綠素有關(guān)酶的活性，使葉綠素正常合成受阻，導(dǎo)致葉綠素含量下降。

由圖2可見(jiàn)，對(duì)照組在Pb濃度≤100 mg·L-1時(shí)，葉綠素含量稍有增加，這是葉綠體在初期表現(xiàn)出了一定抗逆性；接種組在Pb濃度≤200 mg·L-1時(shí)，葉綠素含量由未噴灑Pb（NO3）2時(shí)1.72 mg·kg-1增加到1.9 mg·kg-1。但隨著Pb濃度的增加，接種組和對(duì)照組的蜈蚣草葉綠素含量均開(kāi)始下降，在Pb濃度為600 mg·L-1時(shí)，接種組和對(duì)照組蜈蚣草葉綠素含量分別下降至1.74和1.58 mg·kg-1。但從下降趨勢(shì)可以看出接種組下降較平緩。由此可見(jiàn)，接種產(chǎn)堿菌減輕了重金屬Pb對(duì)蜈蚣草葉綠體的破壞作用。

圖2 不同土壤鉛濃度處理下蜈蚣草葉綠素含量Fig.2 Chlorophyll content of Pteris vittata in different soil lead concentration

2.3 接種耐鉛產(chǎn)堿菌對(duì)土壤酶活性的影響

2.3.1 不同Pb處理對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶活性的影響

過(guò)氧化氫酶主要來(lái)自微生物和植物根系的分泌物，能夠減輕或消除微生物或植物在生理活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的有害H2O2。其活性與土壤有機(jī)質(zhì)含量、微生物的數(shù)量有關(guān)，可以表征土壤腐殖化強(qiáng)度和有機(jī)質(zhì)積累程度。劉敬武等研究表明Pb對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶有明顯激活作用，只有當(dāng)Pb濃度達(dá)到1 000 mg·kg-1時(shí)酶的活性才略有下降[15]。

圖3a表示種植蜈蚣草的土壤，在不同濃度Pb處理?xiàng)l件下，接種組和對(duì)照組過(guò)氧化氫酶活性變化。由圖可見(jiàn)，對(duì)于對(duì)照組，在重金屬Pb濃度逐漸升高的情況下，土壤過(guò)氧化氫酶活性出現(xiàn)波動(dòng)現(xiàn)象，即在Pb濃度為100及400 mg·kg-1時(shí)表現(xiàn)出被激活而升高的現(xiàn)象，但在Pb濃度由100 mg·kg-1上升至 200 mg·kg-1及 400 mg·kg-1上升至600 mg·kg-1的階段，土壤過(guò)氧化氫酶活性又表現(xiàn)為被抑制而下降現(xiàn)象；但對(duì)于接種組，在Pb濃度不斷升高的情況下，其過(guò)氧化氫酶活性未受到顯著影響。

圖3 不同土壤鉛濃度處理對(duì)土壤酶活性的影響Fig.3 Effects of different soil lead concentrations on soil enzyme activity

2.3.2 不同Pb處理對(duì)土壤磷酸酶活性的影響

土壤的磷酸酶活性可以分為酸性磷酸酶、中性磷酸酶和堿性磷酸酶3種，主要由土壤pH決定。本試驗(yàn)土壤的pH接近7.0，屬于中性磷酸酶。研究表明，在Pb污染的土壤中，其磷酸酶活性受Pb濃度的影響各異，這主要由土壤的性質(zhì)決定。Yang等研究表明Pb濃度的升高可以提高土壤堿性磷酸酶的活性，但對(duì)酸性磷酸酶沒(méi)有明顯影響[16]。Wick等證明磷酸酶活性與土壤含水量有顯著的相關(guān)性，土壤季節(jié)性的含水量的變化對(duì)磷酸酶活有一定的影響[17]。

圖3b表示在不同濃度Pb處理?xiàng)l件下，接種組和對(duì)照組磷酸酶活性變化。由圖可見(jiàn)，隨著Pb濃度的升高，土壤樣品磷酸酶活性并未呈現(xiàn)規(guī)則變化，而且當(dāng)Pb濃度小于400 mg·kg-1時(shí)，處理組與對(duì)照組的磷酸酶活性無(wú)顯著差異；當(dāng)Pb濃度為600 mg·kg-1時(shí)，對(duì)照組磷酸酶活性顯著下降，而接種組下降較平緩?？梢?jiàn)，低濃度的Pb對(duì)磷酸酶的影響較小，且接種耐鉛產(chǎn)堿菌有助于Pb脅迫條件下土壤磷酸酶活性的保持。

2.3.3 不同Pb處理對(duì)土壤轉(zhuǎn)化酶活性的影響

轉(zhuǎn)化酶對(duì)土壤Pb的濃度十分敏感，是土壤Pb污染的重要指標(biāo)之一。但不同土壤、不同環(huán)境下轉(zhuǎn)化酶對(duì)重金屬污染產(chǎn)生的反應(yīng)各不相同。楊娟娟等的研究表明重金屬Pb在7.5和15 kg·hm-2時(shí)，土壤轉(zhuǎn)化酶活性受到明顯的抑制作用，并提出轉(zhuǎn)化酶可以作為土壤Pb污染的明顯指標(biāo)[18]。

圖3c表示不同Pb處理濃度下，接種組和對(duì)照組土壤轉(zhuǎn)化酶活性變化特點(diǎn)。在各濃度Pb處理下，接種組的土壤轉(zhuǎn)化酶活性均高于對(duì)照組。隨著Pb濃度的升高，接種組和對(duì)照組土壤轉(zhuǎn)化酶活性都出現(xiàn)先升高再降低現(xiàn)象。其中，接種組轉(zhuǎn)化酶活性 mg·5 g-1·24 h-1由 50.95（Pb：0）升高至57.4（Pb：200 mg·kg-1）后又下降到55.43（Pb：600 mg·kg-1），而對(duì)照組的轉(zhuǎn)化酶活性則由 42.5（Pb：0）升高至45.6（Pb：200 mg·kg-1）后又降低到36.1（Pb：600 mg·kg-1）。由此可見(jiàn)，接種耐鉛產(chǎn)堿菌有效降低了重金屬Pb對(duì)土壤轉(zhuǎn)化酶活性的影響。

2.3.4 不同Pb處理對(duì)土壤脲酶活性的影響

土壤脲酶對(duì)Pb的耐受力較高，在低濃度Pb污染下，脲酶的活性會(huì)被立刻激活而升高，而這與土壤性質(zhì)有關(guān)系，草甸棕壤Pb濃度達(dá)到1 000 mg·kg-1時(shí)，土壤脲酶活性上升并達(dá)到顯著性差異水平，而紅壤當(dāng)Pb濃度大于500 mg·kg-1時(shí)脲酶的活性就會(huì)下降。楊志新等研究表明，Pb污染在其他重金屬的協(xié)同作用下對(duì)土壤脲酶活性的影響不顯著[19]。

圖3d是在不同濃度Pb處理下，接種組和對(duì)照組的土壤脲酶活性變化情況，由圖可以看出，隨著Pb濃度的升高，接種組和對(duì)照組的土壤脲酶活性總體均呈現(xiàn)小幅上升趨勢(shì)。其中，接種組土壤脲酶活性 mg·g-1·24 h-1由 9.45（Pb：0）升至 11.42（Pb：600 mg·kg-1），而對(duì)照組由 8.7（Pb：0）升至10.06（Pb：200 mg·kg-1）；另外，在Pb濃度由400 mg·kg-1增加到600 mg·kg-1時(shí)，對(duì)照組土壤脲酶活性稍有下降，由10.25下降到10.06。

3 討論與結(jié)論

接種耐鉛產(chǎn)堿菌（Alcaligenes sp.）能夠促進(jìn)蜈蚣草土下部分對(duì)土壤重金屬Pb的吸收，增加向土上部分轉(zhuǎn)移的量；接種耐鉛產(chǎn)堿菌，在低濃度條件下能夠有效降低重金屬Pb對(duì)蜈蚣草葉綠體的破壞，而在高濃度條件下作用不明顯；接種耐鉛產(chǎn)堿菌能夠明顯降低重金屬Pb對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶、磷酸酶及轉(zhuǎn)化酶活性影響，對(duì)脲酶作用不顯著。

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