三種殺菌劑對土壤細菌群落多樣性影響

閆 雷，于 淼，張景欣，李淑芹，侯利園，秦智偉

（1.東北農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱市環(huán)境監(jiān)測中心站，哈爾濱 150076；3.東北農業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030）

農藥對土壤的污染與土壤微生物群落多樣性關系一直是土壤農藥污染生態(tài)評價的熱點問題[1]，農藥大劑量施用，導致農田生態(tài)環(huán)境污染[2-3]，引起環(huán)境微生態(tài)功能及組成（如微生物種群、數(shù)量、酶的種類及活性）改變，從而影響土壤環(huán)境質量，造成生態(tài)破壞。

隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，對于土壤微生物群落的研究從基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物學階段進入免培養(yǎng)的分子生物學階段[4]。出現(xiàn)（2D-PAGE）[5]、基因芯片技術[6]和高通量測序技術[7-8]等新興技術。DGGE（Denaturing gradient gel electrophoresis，變性梯度凝膠電泳）最早是一項用于DNA突變檢測的電泳技術[9]，已經被廣泛應用于各種環(huán)境微生物的生態(tài)研究中，如高熱溫泉、湖泊、海洋、土壤和根際等[10]。國內外有很多關于農藥對土壤微生物群落影響的研究報道[11-13]，Sigler和Turco采用DGGE法研究發(fā)現(xiàn)，殺真菌劑百菌清處理的各種土壤細菌和真菌群落結構與對照土壤存在顯著差異[14]；郝乙杰的研究表明百菌清對土壤微生物群落物種豐富度影響不大[15]；而王秀國研究發(fā)現(xiàn)，多次重復施用多菌靈后，土壤微生物的優(yōu)勢種群大量繁殖，群落豐富度和均一性均呈現(xiàn)增長趨勢[16]。對于代森錳鋅和霜霉威研究少見報道。

百菌清、代森錳鋅和霜霉威是北方蔬菜保護地種植中常用的高效低毒殺菌劑。關于殺菌劑對北方黑土中微生物群落多樣性研究相對較少；對于代森錳鋅和霜霉威的影響研究更不多見。為評價殺菌劑施用的安全性及其對土壤質量的影響，本研究從農藥種類和農藥用量入手，利用PCRDGGE技術，揭示三種殺菌劑對土壤細菌群落多樣性的影響，旨在為農藥的安全性評價提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土樣：試驗土樣采自東北農業(yè)大學香坊實驗實習基地，挖0～20 cm耕作層土壤，在室溫下風干，過1 mm篩備用。土壤理化性質用常規(guī)方法分析[17]，土壤有機質55.39 g·kg-1、全氮3.101 g·kg-1、全磷 1.697 g·kg-1、速鉀126.6 mg·kg-1、堿解氮281.3 mg·kg-1、速磷276.1 mg·kg-1、緩效鉀2 160 mg·kg-1及pH 6.38。

供試農藥：百菌清（純度75%,江陰市利港精細化工廠）；代森錳鋅（純度70%陜西上格之路生物科學有限公司）；霜霉威（又稱普力克，純度722 g·L-1，德國拜耳作物科學公司）均為市售農藥。

1.2 農藥處理

稱取相當于200 g干土的新鮮土樣，置于紙杯當中，調節(jié)土壤含水率達到20%，添加以水稀釋的農藥標準溶液，使三種農藥在土壤中濃度分別達到50、100、200和500 mg·kg-1，以不加農藥的土壤作為對照，放入人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后從各處理中取出2 g土樣分別進行土壤細菌群落多樣性的測定。

1.3 土壤微生物總DNA的提取和純化

參照Zhou[18]和Watanabe[19]方法提取土壤DNA，用DNA回收試劑盒，按照純化試劑盒說明書完成對DNA的純化過程。純化前后的DNA產物經瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.4 細菌16S rDNA基因的PCR擴增

采用細菌16S rDNA V3區(qū)通用的引物[20]對341-f和534-r進行PCR，擴增片斷長度為250 bp。擴增產物直接用于變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析。

341-f：5'ATTACCGCGGCTGCTGG 3'534-r：5'（GC）-CCTACGGGAGGCAGCAG 3'（GC）clamp:CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G

1.5 PCR產物的變性梯度凝膠電泳（DGGE）

聚丙烯酰胺的濃度為8%，變性劑梯度為40%～60%。變性劑膠溶液的配制及電泳的操作步驟參照周?；ǖ姆椒╗21]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

通過BIO-RAD的凝膠影像系統(tǒng)所呈現(xiàn)電泳條帶，利用分析軟件Quantity one 4.6.2進行分析處理，數(shù)據(jù)處理過程中同時還應用到統(tǒng)計軟件SPSS13.0和Excel 2003等軟件。

2 結果與分析

2.1 殺菌劑對土壤細菌群落多樣性影響指紋圖譜

圖1為殺菌劑處理后土壤細菌16S rDNA的DGGE圖譜。DGGE可以根據(jù)DNA解鏈行為的不同，檢測發(fā)生單個堿基變化的DNA片段，或分離具有相同長度但不同序列的DNA。圖中的每一個條帶都代表土壤樣品微生物群落中的一種細菌，條帶的濃淡度則代表這種細菌數(shù)量的多少和豐富程度。所得圖像經軟件Quantity One 4.6.2分析、數(shù)字化并扣除背景強度后，檢測出條帶的位置、強度及數(shù)目（如圖1所示）。

圖1 殺菌劑處理后土壤細菌16S rDNA的DGGE圖譜Fig.1 16S rDNA PCR-DGGE profiles of greenhouse soil bacteria after treatment with fungicides

從圖1可以看出，樣品圖譜在條帶數(shù)目和位置上有一定差異。其條帶數(shù)為14～20條不等，其中空白樣品的條帶數(shù)為16條，條帶數(shù)目最多的是經霜霉威200 mg·kg-1濃度處理的樣品；經霜霉威100 mg·kg-1濃度處理的樣品條帶數(shù)最少。同時，DGGE各條帶間具有很高的相似性，許多條帶是共有的，只是亮度存在差異，如條帶2、6、7、13和16等。說明這些條帶代表的細菌具有一定的耐受性，基本不受殺菌劑濃度和種類的影響。而另一些條帶所代表的微生物在受到外來藥劑的影響后表現(xiàn)出復雜變化：如對于某優(yōu)勢種（條帶2）來說，在施入500 mg·kg-1的百菌清后條帶亮度明顯變暗，而200 mg·kg-1的代森錳鋅處理后條帶卻亮度很大；高濃度霜霉威施用后，使條帶數(shù)目不但沒有減少反而增加，說明在高濃度霜霉威誘導下產生了新的細菌種類，使土壤細菌多樣性增加；從條帶深淺來看，這些新增細菌種群中有些逐漸成為優(yōu)勢微生物。

2.2 土壤細菌群落結構DGGE圖譜的主成分分析（Principal component analysis，PCA）

土壤細菌群落結構DGGE圖譜的主成分分析見圖2，可進一步顯示不同樣品土壤細菌群落結構組成的差異。得到3個主成分PC1、PC2和PC3，分別解釋了總變異的33.01%，20.99%和16.01%，累積方差貢獻率達70.01%。

從圖2可以看出，在以3個主成分為坐標軸構建的三維坐標系中，13個土壤樣本之間出現(xiàn)明顯的空間分異。其中PC1主要由L1決定，PC2主要由L10決定，說明與空白相比各處理殺菌劑對土壤微生物群落均存在差異，而受影響最嚴重的為霜霉威50 mg·kg-1，其他處理的微生物種群對于外來農藥的污染敏感性較弱，影響不顯著。

2.3 土壤細菌群落結構DGGE圖譜的聚類分析

殺菌劑處理后土壤細菌16S rDNA DGGE指紋圖譜的聚類分析見圖3，表明各處理土壤細菌種群之間親緣關系的遠近。其結果顯示：所有供試土樣的遺傳相似性為30%，在50%的相似性水平處可將13個供試土樣分為三類，霜霉威50 mg·kg-1獨自一簇，表明該土樣細菌多樣性與其他樣本之間存在明顯的遺傳多態(tài)性差異，這與以上PCA的結論“受影響最嚴重的為霜霉威50 mg·kg-1”相一致；除了100 mg·kg-1濃度外，百菌清處理后，細菌聚類分析時歸為一類，說明濃度為50、200和500 mg·kg-1的百菌清對土壤細菌種群影響相近，且50 mg·kg-1濃度處理的百菌清與對照樣本之間有較高的相似性，表明該濃度處理的百菌清對土壤細菌微生物幾乎無影響；其他8個處理成一簇，說明其他處理供試土樣均對細菌種群產生了不同程度的影響，但在遺傳上存在較小的遺傳差異。

圖2 土壤細菌群落結構DGGE圖譜的主成分分析Fig.2 Principle components analysis of bacteria community in greenhouse soil based on DGGE profile

圖3 殺菌劑處理后土壤細菌16S rDNA DGGE圖譜的聚類分析樹狀Fig.3 Cluster analysis of 16S rDNA PCR-DGGE profiles of greenhouse soil bacteria after treatment with fungicides

3 討論與結論

與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，DGGE技術進行微生物多樣性分析優(yōu)點是突變檢出率高、檢測片段長度長、重復性好等[22]，也存在局限性，如DGGE所檢測的DNA片段長度一般都在300～1 000 bp，只能鑒定到屬[23]。本研究對土壤細菌群落作PCR-DGGE淺層次分析，而未對DGGE圖譜上出現(xiàn)的特異性條帶進行回收和分子克隆，沒有考慮該影響因素，今后應將受影響細菌群落作深入研究。

土壤細菌在高濃度霜霉威誘導下增加新種群，使細菌多樣性增加，有些種群逐漸成為優(yōu)勢種群。低濃度霜霉威對土壤細菌微生物群落的影響最大，其他農藥及劑量處理對于外來農藥的污染敏感性較弱，影響不顯著，尤其是低濃度處理的百菌清對土壤細菌群落無影響。

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