阿特拉津降解酶固定化條件優(yōu)化

張 穎，葛世杰，姜 昭，梁海晶，王 溪

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

阿特拉津（Atrazine，簡(jiǎn)稱AT，2-氯—4-乙基胺—6-異丙基胺—1，3，5-三嗪），又名莠去津[1]，適用于一年生禾本科雜草和闊葉雜草，對(duì)多年生雜草也有一定的抑制作用[2]。研究表明，阿特拉津在土壤中殘留期較長(zhǎng)，根據(jù)土壤的理化性質(zhì)不同，其半衰期可長(zhǎng)達(dá)21天到一年[3]。同時(shí)，阿特拉津遷移轉(zhuǎn)化性強(qiáng)，在土壤中可通過地表徑流進(jìn)入地表水或通過淋溶、濕沉降等方式向下沉積進(jìn)入地下水，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)和飲用水源產(chǎn)生污染。阿特拉津還可通過揮發(fā)和浮塵進(jìn)入大氣并通過沉降返回地面，因此它對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響具有全球性[4]。阿特拉津不僅是一種環(huán)境雌激素并具有潛在的致癌性，它能影響動(dòng)物以及人類的內(nèi)分泌系統(tǒng)，長(zhǎng)期接觸阿特拉津會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物卵巢癌和乳腺癌的發(fā)生，對(duì)人和動(dòng)物造成嚴(yán)重危害[5-6]。因此，如何高效且不造成二次污染降解阿特拉津成為研究熱點(diǎn)。

有關(guān)報(bào)道表明，環(huán)境中的阿特拉津可以通過化學(xué)脫氯和生物降解過程得到降解。隨著生物技術(shù)的不斷成熟，生物修復(fù)被更多的應(yīng)用于有機(jī)污染物的降解中，尤其是對(duì)農(nóng)藥污染的修復(fù)。由于酶生物修復(fù)技術(shù)具有低成本、良好的效果、無二次污染、不會(huì)受到土著微生物排斥等特點(diǎn)，一直被認(rèn)為是較好的阿特拉津降解方法[7]。大多數(shù)酶易受到外界因素（例如高溫、酸、堿）影響而失去活性。采用固定化酶技術(shù)能有效保護(hù)酶，讓酶保持其原有催化功能，還可使酶擁有更好的降解效果[8]。

本文通過單因素試驗(yàn)研究不同材料濃度，pH和溫度等環(huán)境因素對(duì)固定化阿特拉津降解酶降解能力影響，結(jié)合主成分分析結(jié)果，篩選出對(duì)固定化阿特拉津降解酶降解效果影響較大的因素，將篩選出的因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，最終確定固定化阿特拉津降解酶的最佳條件，為進(jìn)一步利用阿特拉津降解酶修復(fù)環(huán)境污染奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜儀（日本島津公司GC-14C）；HSZ-H型水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；

阿特拉津（純度＞97%，山東農(nóng)藥研究所）；聚陰離子纖維素（簡(jiǎn)稱PAC，保定市勝輝聚合物科技有限公司）；海藻酸鈉（天津百世公司）；殼聚糖（SOLARBIO公司）；氯化鎳、三氯甲烷、乙酸、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉均為分析純。

1.2 阿特拉津降解酶的來源

本試驗(yàn)使用的降解酶由分別提取自表達(dá)trzN，atzB和atzC三類阿特拉津降解基因重組菌株中的功能酶混合而成。上述三種重組菌株的構(gòu)建由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司協(xié)助完成。

1.3 阿特拉津降解酶的提取

菌體培養(yǎng)：重組菌體以1%的接種量接到500 mL的LB培養(yǎng)液中，在37℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)，當(dāng)OD600值達(dá)到0.5～0.6之間時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol·L-1IPTG，之后在11℃誘導(dǎo)12h。

粗酶液制備：離心（5 000 r·min-1、10 min），收集500 mL表達(dá)目標(biāo)蛋白的大腸桿菌，用破菌緩沖液潤(rùn)洗3次后重懸于20 mL破菌緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl、1 mmol·L-1PMSF 和細(xì)菌蛋白抑制劑，pH 8.0）超聲破菌，破碎功率為350 W，破碎2 s停3 s，在冰浴條件下持續(xù)破碎10～20 min。破碎結(jié)束后，于4℃，11 000 r·min-1條件下離心15 min，取上清，得粗酶液。

1.4 阿特拉津的提取及分析方法

本試驗(yàn)采用等體積三氯甲烷液-液萃取的方法來提取溶液中的阿特拉津[9]，采用氣相色譜法測(cè)定阿特拉津的含量，并計(jì)算出阿特拉津的降解率[10]。

1.5 固定化阿特拉津降解酶的制備

海藻酸鈉用蒸餾水加熱至完全溶解，聚陰離子纖維素用溫水將其完全溶解，將其按照一定的比例混合于150 mL三角瓶中，將1.3中提取的阿特拉津降解粗酶液（蛋白濃度為0.6775 mg·mL-1）按照一定比例與海藻酸鈉-聚陰離子纖維素溶液混合。適量氯化鎳和殼聚糖先后用1%的醋酸溶解于150 mL三角瓶中，待殼聚糖完全溶解后，用無菌注射器吸取粗酶液和一定濃度的海藻酸鈉-聚陰離子纖維素混合液，逐滴滴入到1%醋酸溶解的一定濃度的氯化鎳和殼聚糖混合溶液中形成小球，靜置30 min后備用。

1.6 固定化阿特拉津降解酶降解能力的測(cè)定

將配制好的0.05 mol·L-1、pH為7的磷酸鹽緩沖液，滅菌，分裝到10 mL離心管中，每個(gè)離心管中5 mL，加入阿特拉津使其在緩沖液中的終濃度為100 mg·L-1。在每個(gè)離心管中再加入3 g固定化酶（約含3 mL酶和固定化材料的混合液），根據(jù)試驗(yàn)需要，在適宜的恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h，期間要反復(fù)倒置離心管使反應(yīng)更加充分。反應(yīng)結(jié)束后按1.4所述方法提取阿特拉津，并計(jì)算固定化酶對(duì)緩沖液中阿特拉津的降解率。

1.7 固定化降解酶條件的優(yōu)化

按1.5中固定化小球制備的方法，研究不同海藻酸鈉濃度（1%、1.5%、2%、2.5%、3%）、聚陰離子纖維素濃度（1%、1.3%、1.5%、1.7%、2%）、殼聚糖濃度（0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.5%）、氯化鎳濃度（0.06、0.08、0.1、0.12、0.15 mmol·L-1）、加酶量（0.15、0.25、0.5、0.75、1 mL）、海藻酸鈉占材料的比例（33.3%、50%、66.7%、80%、100%）、pH（6、7、8、9、10）和溫度（20 ℃、23℃、25℃、27℃、30℃）對(duì)固定化阿特拉津降解酶降解效果影響。酶促反應(yīng)條件同1.6所述，反應(yīng)結(jié)束后按前文1.4描述方法計(jì)算上述不同條件下制備的各類固定化酶的降解率。利用SPSS軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行主成分分析，篩選出主要因素，進(jìn)行3水平的正交試驗(yàn)，以不同處理中固定酶對(duì)阿特拉津的降解率為研究對(duì)象。同樣參照1.6的方法進(jìn)行反應(yīng)，按照1.4的方法計(jì)算降解率。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)部分采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。

圖1 不同材料的濃度對(duì)固定化阿特拉津降解酶降解效果的影響Fig.1 Degradation ability of the immobilized degradation enzyme of atrazine at the concentration of different materials

2 結(jié)果與分析

2.1 降解酶固定化條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

由圖1（a）可知，當(dāng)海藻酸鈉的濃度為1%的時(shí)候，不能成球。固定化降解酶在海藻酸鈉濃度為1.5%的時(shí)候降解率達(dá)到22.16%，是最適濃度，隨著海藻酸鈉濃度的繼續(xù)增長(zhǎng)，降解率逐漸下降在2.5%時(shí)達(dá)到最低的10.73%，之后有所上升。

從圖1（b）的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)PAC為1.5%時(shí)，阿特拉津達(dá)到最高的降解率19.19%，隨后降解率逐漸降低，濃度2%的聚陰離子纖維素溶解后，粘稠度過高無法成球。

如圖1（c）所示，隨著殼聚糖濃度的增加降解率逐漸升高，在1%達(dá)到最高，降解率為24.06%，之后降解率不斷降低，當(dāng)殼聚糖的濃度為1.5%，無法成球。

由圖1（d）可以看出，氯化鎳濃度0.06～0.08 mmol·L-1，降解率明顯上升，在0.08 mmol·L-1達(dá)到最高，之后平穩(wěn)下降，但在0.15 mmol·L-1時(shí)的降解率比0.06 mmol·L-1高。

由圖2（a）可以看出pH在6到8之間，阿特拉津的降解率逐漸升高，在pH=8時(shí)達(dá)到最高的15.84%。之后降解率先降低后升高，當(dāng)pH為10時(shí)，降解率為13.29%。

如圖2（b）所示，當(dāng)溫度20～27℃，隨著溫度的升高，阿特拉津的降解率也逐漸升高，在27℃時(shí)達(dá)到最高的24.28%，之后降解率略有降低。從結(jié)果中可見pH 8，溫度為27℃時(shí)，阿特拉津都表現(xiàn)出良好的降解率。

如圖3（a）所示，隨著加酶量的增加，阿特拉津的降解率逐漸升高，在加酶量為0.5 mL時(shí)降解率達(dá)到最高并趨于平緩，0.75 mL之后降解率略有降低。由圖3（b）可以看出，隨著海藻酸鈉在材料中的比例增加，阿特拉津的降解率先升高后降低，當(dāng)海藻酸鈉占材料的比例為66.7%時(shí)，降解率達(dá)到最高的19.19%。

圖2 （a）pH（b）溫度對(duì)固定化阿特拉津降解酶降解效果的影響Fig.2 （a）pH（b）Temperature for the effect of degradation ability of the immobilized degradation enzyme of atrazine

圖3 （a）酶和材料的比例（b）海藻酸鈉占材料的體積對(duì)固定化阿特拉津降解酶降解效果的影響Fig.3 （a）The ratio of the enzyme and materials（b）Sodium alginate proportion of material for the effect degradation ability of the immobilized degradation enzyme of atrazine

2.2 影響固定化酶活性的主要因素分析

由表1可知，相關(guān)陣的特征值分別為4.271，2.217，1.054，由于前3個(gè)特征值累積的貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到94.26%，所以前三個(gè)成分就可以替代4個(gè)成分進(jìn)行主成分分析。用SPSS軟件進(jìn)行主成分分析，提取3個(gè)主成分，第一個(gè)主成分中海藻酸鈉的濃度，pH和聚陰離子纖維素的濃度系數(shù)比較大，說明該主成分是反應(yīng)第一個(gè)主成分中海藻酸鈉的濃度，pH和聚陰離子纖維素的濃度信息，第二個(gè)主成分中溫度的系數(shù)比較大，說明該主成分反映的是溫度信息。第三個(gè)成分中所有因素的系數(shù)都較小，所以經(jīng)主成分分析后，海藻酸鈉的濃度，pH，聚陰離子纖維素的濃度和溫度被篩選出來。

2.3 最佳固定化條件的優(yōu)化

通過SPSS軟件分析篩選出的4個(gè)主要因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以阿特拉津（AT）的降解率（%）為評(píng)價(jià)指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可見，海藻酸鈉濃度的K值K3＞K2＞K1，PAC濃度的K值K1最大，pH K值K1＞K3＞K2，溫度K值K3＞K2＞K1，在該試驗(yàn)條件下最佳的包埋組合為海藻酸鈉的濃度1.75%，PAC的濃度1.4%，pH 7.5，溫度為29℃。從表2極差分析中可以看出R1＞R2＞R4＞R3，表明影響包埋劑固定化方法效果的主要因素是海藻酸鈉濃度，依次分別是PAC的濃度、溫度、pH。

表1 因素主成份分析Table1 Principal component analysis of the study factors

圖4 三個(gè)旋轉(zhuǎn)成分的載荷Fig.4 Load of three rotational component

表2 固定化材料優(yōu)化的正交試驗(yàn)Table2 Immobilized material optimization orthogonal test table

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，當(dāng)海藻酸鈉的濃度較低時(shí)，阿特拉津的降解率相對(duì)較高，這是由于高濃度海藻酸鈉的粘稠度過高，表面更加緊密，影響固定化材料的通透性，進(jìn)而降低降解酶的活性[11]。殼聚糖的濃度過高時(shí)，使材料更加致密，固定化酶活力降低[12]，說明高濃度氯化鎳有利于降解酶降解阿特拉津。PAC不能單獨(dú)與1%醋酸的氯化鎳和殼聚糖混合溶液成球，因此，隨著海藻酸鈉在材料中的比例增加時(shí)，固定化小球的成球效果相對(duì)較好[13-14]。阿特拉津降解酶經(jīng)固定化后，依然保持良好的降解效果，可見固定化材料能達(dá)到包埋降解酶目的。從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)?zāi)艽_定最佳固定化方案，極差R值越大，表明該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響越大。

本試驗(yàn)采用海藻酸鈉、聚陰離子纖維素和殼聚糖氯化鎳包埋固定阿特拉津降解酶，通過對(duì)8個(gè)影響固定化效果的單因素試驗(yàn)初步確定固定化材料的濃度和固定化條件；并應(yīng)用SPPS軟件分析篩選出對(duì)固定化酶降解效果影響較大的因素，分別是海藻酸鈉濃度、聚陰離子纖維素的濃度、pH和溫度；最后通過正交試驗(yàn)確定固定化酶的最佳條件為：海藻酸鈉濃度為1.75%，聚陰離子纖維素濃度為1.4%，溫度29℃，pH為7.5。

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