高效氯氰菊酯降解菌的篩選及其降解特性

于 曉 菲，夏 清 風(fēng)，金 朝 霞

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

高效氯氰菊酯，又稱β－氯氰菊酯[1]，是一種擬除蟲菊酯類殺蟲劑。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是模擬天然除蟲菊酯合成的一類殺蟲劑，具有穩(wěn)定、高效、低毒、殺蟲廣譜等特點[2]，是目前農(nóng)業(yè)上使用最為廣泛的殺蟲劑。然而，隨著菊酯類農(nóng)藥的長期使用，其在環(huán)境中大量殘留[3]，并且菊酯類農(nóng)藥半衰期較長，對生態(tài)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品都有污染，影響人們的身體健康[4－5]。此外，菊酯類農(nóng)藥對于家蠶、蜜蜂、水生生物等具有高毒性[6－7]。因此，解決菊酯農(nóng)藥污染已刻不容緩，微生物降解是解決菊酯農(nóng)藥污染 的 重 要 手 段[8－9]。 目 前 對 于 甲 氰 菊 酯[10]、氰戊菊酯[11]、聯(lián)苯菊酯[8，12]、功夫菊酯[13]等菊酯類均有微生物降解的報道，但關(guān)于高效氯氰菊酯特別是濃度較高的高效氯氰菊酯的降解報道較少。為此，筆者篩選出一株能夠降解較高濃度高效氯氰菊酯的菌種DL－3，并對其降解特性做了系統(tǒng)的研究，為其在生物修復(fù)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

1.1.1 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl、K2HPO4、KH2PO4和(NH4)2SO4各1g／L，MgSO4·7H2O 0.5g／L。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.00g／L，酵母膏10.00g／L，NaCl 5.00g／L。

高氯菊酯培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后，加入一定濃度的經(jīng)濾膜過濾除菌的高氯菊酯。

富集培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入0.5%的酵母浸粉。

高氯菊酯／甲醇母液：用甲醇配制終質(zhì)量濃度為10g／L的高氯母液，裝至棕色瓶，陰涼處保存。

1.1.2 試 劑

高效氯氰菊酯原藥：有效成分95.4%，南京榮誠化工有限公司

1.2 菌種的富集及篩選

將采自農(nóng)藥廠污水排放口的活性污泥5.0g置于50mL含有100mg／L高氯菊酯的富集培養(yǎng)基中，37℃、170r／min搖床培養(yǎng)7d，以5%的接種量轉(zhuǎn)接至高氯菊酯為200mg／L的富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，依此類推，轉(zhuǎn)接6次使高氯菊酯終質(zhì)量濃度達(dá)到700mg／L。然后用稀釋涂布法和劃線培養(yǎng)法，于高氯菊酯為100mg／L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)物。將純化后的菌種在含有100mg／L高氯菊酯的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，驗證菌種的高氯菊酯降解效果[8，14]。

1.3 高效氯氰菊酯含量的測定

1.3.1 農(nóng)藥的萃取方法

降解實驗定時取樣，加入等體積的二氯甲烷，旋渦混合器上充分振蕩抽提1min，低溫離心10min除菌，取下層有機(jī)相檢測樣品殘留農(nóng)藥濃度。

1.3.2 紫外分光光度計測定高效氯氰菊酯含量

菌種初篩階段，將萃取后的樣品用紫外分光光度計在278nm處測定高氯菊酯的含量。

1.3.3 氣相色譜測定高效氯氰菊酯含量[15]

測定條件：Agilent 6890GC，ECD檢測器，HP－5毛細(xì)管色譜柱(30mm×0.25mm×0.25μm)；載氣：99.999%氮氣，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度280℃，檢測溫度280℃；柱溫采用程序升溫：初溫150℃，以每分鐘25℃升溫至260℃，在此溫度停留10min。

1.4 菌種的鑒定

1.4.1 16SrDNA鑒定

挑取降解菌單菌落于10μL超純水中，混勻，于PCR儀中99℃裂解10min，以此裂解液作為菌落PCR的模板擴(kuò)增菌株的16SrDNA。擴(kuò)增引物分別為：正向引物：5′－AGAGTTGATCCTGGCTCAG－3′；反 向 引 物：5′－GGTTACCTTGTTACGGCTT－3′[5]。50μL 反應(yīng)體系：模板裂解液，1μL；dNTPs (10mmol／L)，1μL；10×Taq緩沖液，5μL；引物，各1μL；Taq酶(5U／μL)，0.5μL；超純水，40.5μL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件：94℃預(yù)變性，4min；94℃，1min；55℃，45s；72℃，90s，循環(huán)30次，72℃延伸5min[5]。采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物后，交由基因公司測序。測序完成獲得的結(jié)果利用Phylip 3.67軟件，采用鄰接法，構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.2 菌株形態(tài)及生理生化特性測定

通過菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化特性對菌種進(jìn)行鑒定，生理生化測定參照文獻(xiàn)[9－10]。

1.5 各種因素對菌種生長及降解能力的影響

1.5.1 碳源對菌種降解能力的影響

以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的OD600＝1.0的菌種作為種子液，按5%的接種量分別接種于含有1g／L半乳糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和乳糖等的高效氯氰菊酯培養(yǎng)基中，菊酯質(zhì)量濃度為100mg／L，170r／min、37℃培養(yǎng)7d后測定菌種的生長狀況和農(nóng)藥降解情況。

1.5.2 氮源對菌種降解的影響

以5%的接種量將菌種分別接種于含有1g／L(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl、酵母浸粉和蛋白胨的高效氯氰菊酯培養(yǎng)基中，菊酯質(zhì)量濃度為100mg／L，170r／min、37℃培養(yǎng)7d后測定菌種的生長狀況及農(nóng)藥降解情況。

1.5.3 pH對菌種降解能力的影響

以5%的接種量將菌種分別接入pH 5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的高效氯氰菊酯培養(yǎng)基中，菊酯質(zhì)量濃度為100mg／L，培養(yǎng)7d后測定菌種的生長狀況和農(nóng)藥降解狀況。

1.5.4 溫度對菌種降解能力的影響

將菌種種子液以5%的接種量接入100mg／L高效氯氰菊酯培養(yǎng)基中，分別在25、30、37和45℃培養(yǎng)7d，測定菌種的生長情況和農(nóng)藥降解狀況。

1.5.5 底物濃度對菌種降解能力的影響

控制高效氯氰菊酯培養(yǎng)基中農(nóng)藥的質(zhì)量濃度分別為100、200、300和400mg／L，接入菌種種子液，培養(yǎng)7d后測定菌種的生長和農(nóng)藥降解狀況。

1.5.6 菌種的降解譜

將菌種分別接入含有100mg／L氰戊菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、甲氰菊酯和聯(lián)苯菊酯的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7d后測定菌種的生長狀況和農(nóng)藥降解狀況。

以上實驗均以相同條件下不接菌的空白樣作為對照。

1.6 菜園土壤高氯菊酯農(nóng)藥降解實驗

從菜園地中取土壤1kg，噴灑含有高效氯氰菊酯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，農(nóng)藥的終濃度為100mg／kg，向土壤中倒入經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的OD600＝1.0的菌DL－3懸液5mL，攪拌均勻后自然培養(yǎng)，7d后取樣，用二氯甲烷萃取后，測定高效氯氰菊酯含量，計算降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌的篩選與鑒定

通過富集培養(yǎng)分離純化得到一株能夠降解高效氯氰菊酯的菌種，命名為DL－3。在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，DL－3對高效氯氰菊酯的降解率約為67.5%。DL－3為G＋，短桿狀，MR實驗陽性，不能以檸檬酸鹽和丙二酸鹽作為碳源生長，不產(chǎn)苯丙氨酸脫氨酶，產(chǎn)生接觸酶，葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。根據(jù)菌株DL－3的16SrDNA序列以及相關(guān)菌株的16SrDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1。由圖 1 可 知，菌 DL－3 與 菌 株B.anthracisATCC14186以及B.cereusATCC BAA－1005同源性較高，初步鑒定為芽孢桿菌屬[16]。

2.2 菌種生長量和農(nóng)藥降解能力的影響

2.2.1 碳 源

在含有高效氯氰菊酯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入不同種類的碳源，菌種的生長量和農(nóng)藥降解率如表1所示。由表1可知，添加額外的碳源能夠大大提高菌種的降解能力，其中添加單糖效果最佳，二糖次之，多糖最差。

圖1 根據(jù)菌種DL－3及相關(guān)菌種16SrDNA序列同源性建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree based on the 16SrDNA sequences of DL－3and related strains

表1 碳源對菌DL－3生長量和高效氯氰菊酯降解率的影響Tab.1 Effect of carbon source onβ－CP degradation rate and bacterial growth bacterial growth

2.2.2 氮 源

由表2可知，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中使用硫酸銨在無機(jī)氮源中降解率最高，而有機(jī)氮源對于菌種降解能力略高于硫酸銨，這可能是由于有機(jī)氮源中含有少量碳源，有利于菌種的生長。

2.2.3 溫 度

不同溫度下農(nóng)藥的降解實驗結(jié)果如圖2。菌種在37℃時對農(nóng)藥的降解率最大，為68.2%；30和45℃時降解率分別為40%和60%；25℃明顯抑制了DL－3的降解能力，降解率僅為30%，這可能與細(xì)胞中農(nóng)藥降解酶的活性有關(guān)。

表2 氮源對菌DL－3生長量和高效氯氰菊酯降解率的影響Tab.2 Effect of nitrogen source onβ－CP degradation rate and bacterial growth bacterial growth

圖2 溫度對菌DL－3生長量和高效氯氰菊酯降解率的影響Fig.2 Effect of temperature onβ－CP degradation rate and bacterial growth

2.2.4 pH

pH對菌種降解高效氯氰菊酯的能力影響很大。由圖3可知，菌種在pH 7.0時，降解率可達(dá)70%，pH 9.0的降解率為40%，而pH 4.0時僅為20%，明顯抑制了DL－3的降解能力。

圖3 pH對菌DL－3生長量和高效氯氰菊酯降解率的影響Fig.3 Effect of pH onβ－CP degradation rate and bacterial growth

2.2.5 底物濃度

選取不同濃度的高效氯氰菊酯，降解率的測定結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，DL－3對高效氯氰菊酯的降解率隨著底物濃度的升高而降低，這可能是由于濃度較高的高效氯氰菊酯對菌種的生長有抑制作用。DL－3能在300mg／L的高效氯氰菊酯中保持55%左右的降解率也是比較少見的。

圖4 高氯菊酯質(zhì)量濃度對DL－3生長量和高效氯氰菊酯降解率的影響Fig.4 Effect of initialβ－CP concentration onβ－CP degradation rate and bacterial growth

2.2.6 DL－3降解譜的測定

通過DL－3對不同種類擬除蟲菊酯農(nóng)藥的降解情況，來判斷DL－3對擬除蟲菊酯農(nóng)藥的降解是否具有廣譜性。表3的結(jié)果表明，DL－3對其他菊酯農(nóng)藥的降解率僅略低于對高效氯氰菊酯的降解，因此可以判定DL－3具有廣譜性。由于農(nóng)藥殘留污染往往具有種類多的特點，DL－3具有一定實際應(yīng)用價值。

表3 菌DL－3對不同種類菊酯的降解能力Tab.3 Degradation of different pyrethroids by strain DL－3

2.3 菜園土壤高效氯氰菊酯農(nóng)藥降解實驗

菜園土壤中農(nóng)藥萃取后利用氣相色譜進(jìn)行分析，高效氯氰菊酯的降解率僅為40%。這可能是菌種對高效氯氰菊酯的降解受外界條件影響較大，菜園土壤中的條件諸如pH、溫度、通氣情況等，不利于高效氯氰菊酯的降解。

3 結(jié) 論

篩選出一株能夠以高效氯氰菊酯作為唯一生長碳源的菌種DL－3。DL－3對100mg／L高效氯氰菊酯的降解率為67.5%，經(jīng)16SrDNA分子生物學(xué)和生理生化鑒定確定DL－3為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

添加一定營養(yǎng)成分有利于DL－3對高效氯氰菊酯的降解，DL－3降解菊酯農(nóng)藥的適宜溫度為30～40℃，pH 為6.0～8.0。DL－3對高效氯氰菊酯的降解能力隨農(nóng)藥濃度增加而減小，高濃度的高效氯氰菊酯對DL－3的生長有一定的抑制作用。DL－3對菊酯類農(nóng)藥的降解具有廣譜性。DL－3所產(chǎn)高效氯氰菊酯降解酶以胞內(nèi)酶為主。

DL－3能在農(nóng)藥質(zhì)量濃度在200～300mg／L時仍然能保持50%左右的降解率，這在目前農(nóng)藥降解的研究中是比較少見的，同時也為利用微生物解決環(huán)境中菊酯農(nóng)藥的污染和殘留問題提供了一定的理論依據(jù)。但也應(yīng)該看到，由于土壤環(huán)境復(fù)雜，菌種的降解能力并不能達(dá)到實驗室中水平。所篩選的菌種可以通過誘變及基因工程等技術(shù)手段，進(jìn)一步增強其菊酯農(nóng)藥降解能力。

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