人參果多酚氧化酶的酶學(xué)特性及純化

祁 立 波, 褚 津, 鄭 皎 皎, 姜 鵬 飛, 朱 蓓 薇

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034;2.大連魁氏食品有限公司, 遼寧 大連 116101 )

0 引 言

人參果(Solanummuricatum)是多年生茄科草本植物,其果實(shí)爽甜多汁、風(fēng)味獨(dú)特、清香宜人,是制作果汁的良好原料。人參果具有低糖、低脂、高蛋白的特點(diǎn),并含有豐富的維生素及礦物質(zhì)元素,硒和鈣的含量尤其高,在我國(guó)蔬菜和水果品種中是非常少見的[1]。研究認(rèn)為長(zhǎng)期食用人參果可增強(qiáng)人體的免疫功能,延緩衰老,保護(hù)眼組織、皮膚、心臟和肝臟[2],被譽(yù)為“生命火種”、“抗癌大王”。因此,對(duì)人參果進(jìn)行進(jìn)一步的加工利用有重要的現(xiàn)實(shí)意義。此外,多酚氧化酶引起的酶促褐變會(huì)對(duì)果肉和果汁的色澤產(chǎn)生較大影響[3],這種情況同樣影響了人參果的加工。多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,簡(jiǎn)稱PPO)是一種自然界普遍存在的以銅為輔基的氧化還原酶,能催化酚類物質(zhì)氧化成醌,醌類物質(zhì)再進(jìn)一步氧化合成黑色素[4]。不同來(lái)源的PPO的酶學(xué)特性有所差異。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)果蔬中PPO等酶類的研究已有不少報(bào)道,如花椰菜[5]、草莓[6]和香蕉[7]等,但對(duì)人參果PPO酶學(xué)特性的研究卻鮮見報(bào)道。作者從人參果果肉中提取得到PPO,并對(duì)其酶學(xué)特性加以研究,以探明其引起酶促褐變的反應(yīng)條件,從而為加工過(guò)程中人參果褐變的有效控制提供支撐。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

人參果:購(gòu)自大連市雙興批發(fā)市場(chǎng),4 ℃貯藏。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

T25數(shù)顯勻漿機(jī),德國(guó)艾卡集團(tuán)；T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Z323K型冷凍離心機(jī),德國(guó)哈默機(jī)床有限公司；HH-S型數(shù)顯水浴鍋,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；JJ200型電子天平,常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；XW-80A旋渦混合器,上海青浦滬西儀器廠；YC-1層析實(shí)驗(yàn)冷柜,北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PPO粗酶液的提取

人參果洗凈去皮后,取果肉100 g,立即加入預(yù)冷丙酮(-20 ℃)150 mL,勻漿2 min,用布氏漏斗抽濾。濾餅用100 mL預(yù)冷丙酮進(jìn)行再次提取和抽濾后即得PPO丙酮粉[8]。取丙酮粉5 g溶于50 mL pH 6.8的預(yù)冷(4 ℃)磷酸鹽緩沖液中,用磁力攪拌器攪拌15 min后12 000 r/min離心20 min,過(guò)濾取上清液,即為人參果PPO粗酶液[8]。

1.2.2 PPO活性的測(cè)定

在比色皿中分別加入pH 6.0的磷酸鹽緩沖液1 mL、0.1 mol/L鄰苯二酚溶液1 mL和PPO粗酶液0.4 mL,立即混勻后測(cè)OD400nm。酶液加入時(shí)開始計(jì)時(shí),每15 s記錄1次OD值,每組測(cè)量3次,取平均值,以最初直線段斜率(OD/t)表示酶活力。一個(gè)酶活力單位(U)定義為:在上述條件下,每分鐘引起吸光度改變0.001所需的酶量[9-10]。

1.2.3 pH對(duì)PPO活性的影響

按“1.2.2”所述方法,分別選擇具有不同pH的緩沖液,包括檸檬酸緩沖液(0.2 mol/L,pH 3.6～5.6)和磷酸二氫鉀緩沖液(0.2 mol/L,pH 6.0～8.0),考察pH對(duì)PPO活性的影響[8]。

1.2.4 溫度對(duì)PPO活性的影響

在比色皿中分別加入pH 6.0的磷酸鹽緩沖液1 mL和0.1 mol/L的鄰苯二酚溶液1 mL,在一定溫度(20～70 ℃)下保溫5 min,然后加入相同溫度下保溫5 min的粗酶液0.4 mL,立即測(cè)定OD400nm,考察溫度對(duì)PPO活性的影響。

1.2.5 PPO米氏常數(shù)(Km)的測(cè)定

在比色皿中分別加入用pH 6.0的磷酸鹽緩沖液配制的不同濃度鄰苯二酚溶液(2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mmol/L)2.6 mL和粗酶液0.4 mL,立即測(cè)定酶活性。用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法繪出動(dòng)力學(xué)曲線,計(jì)算Km。

1.2.6 PPO粗酶液的純化

參考文獻(xiàn)[11]的方法,分別采用丙酮沉淀法和硫酸銨沉淀法對(duì)PPO粗酶液進(jìn)行純化。采用福林酚法測(cè)定其蛋白含量,并按照方法“1.2.2”測(cè)定純化后酶液的酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPO的酶活力

人參果PPO在4 min之內(nèi)的活力反應(yīng)情況如圖1所示。由圖1可以看出,在反應(yīng)最初的1.5 min內(nèi),OD值呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì),說(shuō)明初始階段PPO酶的反應(yīng)速度很快。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),反應(yīng)速度逐漸減緩,OD值增長(zhǎng)緩慢,逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期,可能是由于隨著酶促可逆反應(yīng)的進(jìn)行,底物濃度逐漸降低,產(chǎn)物濃度逐漸增加,以及pH和溫度等因素的影響使酶失活,它們共同導(dǎo)致了酶促反應(yīng)逆反應(yīng)的加速[12]。在0～1 min內(nèi),OD值的變化線性較好,能夠充分反映PPO的活性。因此,在人參果PPO活性的測(cè)定中,可以用1 min之內(nèi)OD值隨時(shí)間的變化速度來(lái)表示酶活力。

圖1 人參果PPO反應(yīng)進(jìn)程曲線Fig.1 The reaction course curve of Solanum muricatum PPO

2.2 PPO的最適反應(yīng)pH

pH對(duì)PPO活性的影響如圖2所示。由圖2可以看出,反應(yīng)體系的pH對(duì)人參果PPO的酶活力影響非常顯著。在pH 3.6～5.4,隨著pH升高,PPO的活性先升高后降低,在pH為4.8時(shí)為最大值。之后,隨著pH的進(jìn)一步升高,PPO的活性雖出現(xiàn)相同的變化趨勢(shì),但活性明顯增強(qiáng)。pH 為6.8時(shí)PPO的酶活性最高,這可能與PPO的活性部位含有組氨酸基團(tuán)(pK=6.0)有關(guān)[13]。此外,PPO是堿性蛋白質(zhì),在較強(qiáng)的酸性條件下,輔基銅以銅離子的形式解離,而在堿性條件時(shí),輔基銅則會(huì)解離成Cu(OH)2[14],所以過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境都會(huì)降低人參果PPO的酶活性。

圖2 pH對(duì)人參果PP0活性的影響Fig.2 Effects of pH on Solanum muricatum PPO activity

2.3 PPO的最適反應(yīng)溫度

溫度對(duì)PPO活性的影響如圖3所示。在實(shí)驗(yàn)所考察的溫度范圍內(nèi),隨著反應(yīng)溫度的升高,人參果PPO的酶活性整體呈下降趨勢(shì)。在20～40 ℃ PPO的活性較穩(wěn)定,且在30 ℃時(shí)活力相對(duì)最高,因此可以確定30 ℃為人參果PPO反應(yīng)的最適溫度,這與Dincer[15]和Dogan[16]等報(bào)道的枸杞果和茄子等PPO的最適溫度一致。當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí),溫度越高,酶活力越低。溫度升高,在加快酶促反應(yīng)速度的同時(shí),也會(huì)對(duì)酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響,導(dǎo)致酶活力下降,因此,PPO的最適反應(yīng)溫度是這2種影響綜合作用的結(jié)果[17]。40 ℃ 以下時(shí),溫度對(duì)人參果PPO酶促反應(yīng)的加速起主導(dǎo)作用,但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí),高溫對(duì)酶蛋白結(jié)構(gòu)或活力的破壞起主導(dǎo)作用。

圖3 溫度對(duì)人參果PPO活性的影響Fig.3 Effects of temperatures on Solanum muricatum PPO activity

2.4 PPO的米氏常數(shù)

圖4為根據(jù)雙倒數(shù)作圖法繪制的動(dòng)力學(xué)曲線。由圖4可以得到人參果PPO的米氏常數(shù)Km=4.4 mmol/L,相應(yīng)的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程為V=2 000[S]/(4.4+[S])。Km是酶的基本特征常數(shù),反映酶與底物結(jié)合及解離的性質(zhì)。Km代表反應(yīng)速度達(dá)到最大速度一半時(shí)的底物濃度,Km越小說(shuō)明底物與酶結(jié)合的親和力越強(qiáng)。人參果PPO的Km與Dogan等[18]對(duì)百里香PPO的研究結(jié)果相似,但因品種的差異還是有所不同。

圖4 米氏常數(shù)的測(cè)定Fig.4 Determination of Km

2.5 PPO的純化

分別選用具有不同飽和度的丙酮和硫酸銨對(duì)人參果PPO酶進(jìn)行純化,結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出,丙酮和硫酸銨的飽和度不同,PPO酶的純化效果明顯不同。在飽和度為30%～80%時(shí),隨著飽和度的增加,PPO酶的純化倍數(shù)均呈先升高后降低的變化趨勢(shì),且都在飽和度為50%時(shí)達(dá)到最大值。2種方法的純化結(jié)果如表1所示。

圖5 丙酮、硫酸銨沉淀法純化人參果PPOFig.5 Partial purification of Solanum muricatum PPO by acetone and ammonium sulfate precipitation method

表1 人參果PPO的純化Tab.1 Partial purification of solanum muricatum PPO

3 結(jié) 論

(1)人參果PPO的最適反應(yīng)pH為6.8,最適反應(yīng)溫度為30 ℃,可以通過(guò)改變PPO的反應(yīng)條件來(lái)抑制其酶活。

(2)人參果PPO酶促褐變反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合米氏方程所描述的單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),Km=4.4 mmol/L,以鄰苯二酚為底物的最大反應(yīng)速度為2 000 U/min,相應(yīng)的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程為V=2 000[S]/(4.4+[S])。

(3)經(jīng)丙酮沉淀法純化后,人參果PPO的純化倍數(shù)為3.49,得率為2.26%；經(jīng)硫酸銨沉淀法純化后,人參果PPO的純化倍數(shù)為4.26,得率為8.92%,硫酸銨沉淀法的純化效果更好。

[1] 孫俊秀. 人參果[J]. 四川烹飪高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào),2004(2):21-22.

[2] 解靈芝,李秋菊. 人參果營(yíng)養(yǎng)成分及飲料加工[J]. 遼寧熊岳農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào), 1999, 1(1):57-59.

[3] 湯鳳霞,魏好程,曹禹芒. 芒果多酚氧化酶的特性及抑制研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(12):156-159.

[4] 何思蓮,劉慧霞,周少基,等. 甘蔗多酚氧化酶酶學(xué)特性及應(yīng)用研究[J]. 廣西大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 34(6):827-831.

[5] GAWLIK-DZIKI U, SZYMANOWSKA U, BARANIANK B.Characterization of polyphenol oxidase from broccoli (Brassicaoleraceavat,botrytisitalica) florets[J]. Food Chemistry, 2007, 105(3):1047-1053.

[6] WESCHE-EBELING P, MONTGOMERY M W. Strawberry polyphenol oxidase extraction and partial characterization[J]. Journal of Food Science, 1990, 55(5):1320-1324.

[7] YANG C, FUJITA S, KOHNO K, et al. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from banana (MusasapientumL) peel [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(3):1446-1449.

[8] 劉文山,肖凱軍,郭祀遠(yuǎn). 蘋果多酚氧化酶的提取及其抑制作用的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2006, 22(4):82-84.

[9] HO K. Characterization of polyphenol oxidase from aerial roots of an orchid,Aranda“Christine 130”[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 1999, 37(11):841-848.

[10] UNAL M U. Properties of polyphenol oxidase from Anamur banana (Musacavendishii) [J]. Food Chemistry, 2007, 100(3):909-913.

[11] 張永亮,朱勇. 桑尺蠖多酚氧化酶的分離純化[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(5):69-71.

[12] 彭志英. 食品酶學(xué)導(dǎo)論[M]. 北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2002:120-165,141-149.

[13] 沈金玉,黃家音,李曉莉. 蘆薈多酚氧化酶特性的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(3):21-25.

[14] 張勇,池建偉,溫其標(biāo),等. 香蕉多酚氧化酶褐變性質(zhì)的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30(5):52-57.

[15] DINCER B, COLAK A, AYDIN N, et al. Characterization of polyphenol oxidase from medlar fruits (MespilusgermanicaL. Rosaceae)[J]. Food Chemistry, 2002, 77(1):1-7.

[16] DOGAN M, ARSLAN O, DOGAN S. Substrate specificity, heat inactivation and inhibition of polyphenol oxidase from different aubergine cultivars[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2002, 37(4):415-423.

[17] 李憲臻. 生物化學(xué)[M]. 武漢:華中科技大學(xué)出版社, 2008:148-150.

[18] DOGAN S, DOGAN M. Determination of kinetic properties of polyphenol oxidase fromThymus(Thymuslongicaulissubsp.chaubardiivar.chaubardii)[J]. Food Chemistry, 2004, 88(1):69-77.