醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法的重新驗(yàn)證

黃依玲

藥品微生物試驗(yàn)易受樣品成分、試驗(yàn)條件等多種因素的影響，其結(jié)果不能真實(shí)反映樣品污染的微生物狀況。中國(guó)藥典2005版開始規(guī)定當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定，若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響到檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新驗(yàn)證［1］。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)由于醫(yī)院由于整體搬遷，制劑生產(chǎn)、檢驗(yàn)場(chǎng)所及配制制劑的原料生產(chǎn)廠家發(fā)生改變，對(duì)該院自制制劑的微生物限度檢查方法進(jìn)行重新驗(yàn)證，并與原來的檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較和改進(jìn)，結(jié)果總結(jié)如下。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣品 氨茴香合劑、水合氯醛合劑、ORS-Ⅱ顆粒、10%氯化鉀溶液、33%和50%硫酸鎂溶液、復(fù)方硫酸鎂灌腸液、呋喃西林溶液、鼻軟膏、魚肝油軟膏、硫磺霜、復(fù)方苯酚含漱水、復(fù)方硫磺洗劑、痱子水、0.25%氯霉素溶液、爐甘石散劑、30%氧化鋅油、鏈霉素液狀石蠟滴鼻液(簡(jiǎn)稱鏈?zhǔn)?、呋喃西林麻黃素滴鼻液(O/W乳劑)、麻黃素滴鼻液、碳酸氫鈉滴耳液，共計(jì)21個(gè)品種，每個(gè)制劑品種均實(shí)驗(yàn)3個(gè)批號(hào)。制劑的處方成分按中國(guó)醫(yī)院制劑規(guī)范及本院制劑規(guī)范。

1.2 試驗(yàn)菌株 大腸埃希菌［CMCC(B)44102-1］、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003-1］、枯草芽胞桿菌［CMCC(B)63501-1］、銅綠假單孢菌［CMCC(B)10104-1］、白色念珠菌［CMCC(F)98001-1］、黑曲霉［CMCC(F)98001-1］由廣西食品藥品檢驗(yàn)所提供，驗(yàn)證試驗(yàn)用菌株傳代次數(shù)為3～4代。

1.3 試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)、甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基、十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基(以上培養(yǎng)基由廣西食品藥品檢驗(yàn)所提供)，蛋白胨(廣東環(huán)凱生物科技公司)，氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為分析純。

2 方法

實(shí)驗(yàn)操作按中國(guó)藥典2010版二部附錄微生物限度檢查法［1］中細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法和控制菌檢查方法的驗(yàn)證規(guī)定進(jìn)行。每樣品分別進(jìn)行3次以上獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各次試驗(yàn)的回收率。

2.1 菌液制備 取實(shí)驗(yàn)用菌，臨用前用0.9%氯化鈉溶液分別制備成每毫升含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液和孢子菌液，每次預(yù)計(jì)數(shù)。

2.2 供試液制備 用1∶10供試液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，需要特殊制備供試液的供試品如下：水溶媒的混懸劑如爐甘石散劑、復(fù)方硫磺洗劑，取樣品放置使充分沉降后，小心取上清液10 ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，制成1∶10的供試液。油性混懸制劑如30%氧化鋅油、鏈霉素石臘油滴鼻液放置使自然沉降后，小心取上層澄清油液10 g，加聚山梨酯10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液適量，攪拌使乳化，逐次加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，制成1∶10的供試液，放置使溶液穩(wěn)定，取上清液待測(cè)。抑菌作用強(qiáng)乳膏劑如硫磺霜，取樣品5 g，加聚山梨酯5，卵磷酯1 g，充分?jǐn)嚲?，逐次加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，攪均，放置使充分沉降后，取上清液以500轉(zhuǎn)/min離心3 min，取上層離心液作為1∶20供試液。

磺胺類軟膏劑如鼻軟膏，取樣品10 g，加45℃的乳化劑(5 g司盤80、3 g單硬脂酸甘油酯、10 g聚山梨酯80)，攪拌后，逐次加入45℃的 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，加1%PABA5 ml，制成1∶10 供試液，放置使自然沉降后取上清液待測(cè)。乳化劑和稀釋劑已做稀釋劑對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，回收率均＞70%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證 試驗(yàn)組：取按2.2制備的供試液1 ml和50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，傾入瓊脂培養(yǎng)基，每株實(shí)驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。

菌液組：用平板法分別測(cè)定所加各菌株的試驗(yàn)菌數(shù)。供試品對(duì)照組：取與實(shí)驗(yàn)組同一供試液測(cè)定供試品本底菌數(shù)。計(jì)算回收率(試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)應(yīng)不低于70%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果21個(gè)品種中有10%氯化鉀溶液等9個(gè)品種用常規(guī)方法試驗(yàn)，對(duì)6個(gè)實(shí)驗(yàn)菌均無抑菌作用，回收率均＞70%，與上次驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)方法無變化;而有些品種的有些試驗(yàn)菌回收率低于70%，有些品種的實(shí)驗(yàn)操作方法需作改進(jìn)，見表1。

表1 計(jì)數(shù)驗(yàn)證各試驗(yàn)菌回收率(n=3，%)

2.3.2 控制菌檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證 試驗(yàn)組：取按2.2制備的供試液10 ml及50～100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查，應(yīng)檢出試驗(yàn)菌。

陰性對(duì)照組：方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌的陰性對(duì)照用金黃色葡萄球菌，銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌的陰性對(duì)照均用大腸埃希菌，陰性對(duì)照菌應(yīng)不得檢出，以驗(yàn)證該控制菌檢查方法的專屬性。

結(jié)果大多數(shù)品種按常規(guī)法檢查無抑菌作用，少數(shù)制劑通過培養(yǎng)基稀釋和延長(zhǎng)增菌培養(yǎng)時(shí)間即可排除實(shí)驗(yàn)干擾，見表2。

表2 控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

3．1 與原方法結(jié)果比較，部分制劑微生物檢驗(yàn)方法有所變化，如氨茴香合劑原來用培養(yǎng)基稀釋法，重新驗(yàn)證后用常規(guī)平皿法即可使實(shí)驗(yàn)菌達(dá)到規(guī)定的回收率，而33%、50%硫酸鎂溶液原來用常規(guī)平皿法培養(yǎng)，重新驗(yàn)證結(jié)果3次平行實(shí)驗(yàn)中有的批次枯草桿菌回收率不能達(dá)到70%，因此采用薄膜過濾法。這說明了重新驗(yàn)證的必要性。

3．2 經(jīng)實(shí)驗(yàn)摸索，將原有些劑型的實(shí)驗(yàn)方法做有效的改進(jìn)，使操作更加簡(jiǎn)便易行，各實(shí)驗(yàn)菌得到最穩(wěn)定的回收率。如有抑菌作用的水溶性制劑如硫酸鎂溶液等，或制備成水溶性的供試液如30%氧化鋅油，無論抑菌作用強(qiáng)弱，一律用薄膜過濾法，此法比培養(yǎng)基稀釋法使用平皿少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，器皿易清洗，熟練后操作簡(jiǎn)便易行;對(duì)于混懸液的樣品如30%氧化鋅油、鏈?zhǔn)旱?，在制?∶10供試液前，取數(shù)瓶足量的樣品混合后，靜置使充分沉降，小心吸取上清油液，加聚山梨酯80進(jìn)行乳化，再加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，制成充分分離不溶性成分的1∶10供試液，使在薄膜過濾時(shí)快速易沖洗，避免了原來的檢驗(yàn)方法中將樣品搖勻后取樣制備成1∶10供試液，再進(jìn)行沉降和低速離心，這樣不能將混懸液中不溶性成分充分分離，無法有效進(jìn)行薄膜過濾和沖洗;對(duì)于沉降及低速離心均不易分離的制劑如硫磺霜、呋喃西林麻黃素滴鼻液(乳液)，以及含乙醇制劑如痱子水在用水稀釋制備1∶10供試液時(shí)由于樟腦等成分析出產(chǎn)生少量混濁的樣品，不溶性成分不能完全分離，原來用的薄膜過濾法因堵塞不能有效過濾，應(yīng)用培養(yǎng)基稀釋法。

3．3 控制菌檢查中因有增菌培養(yǎng)，很多在細(xì)菌計(jì)數(shù)時(shí)有抑菌的品種，在控制菌檢查中能檢出試驗(yàn)菌。除了對(duì)抑菌活性較強(qiáng)的抗生素品種用薄膜過濾法外，其余制劑用培養(yǎng)基稀釋法延長(zhǎng)增菌時(shí)間能有效排除抑菌作用。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(二部)2010版，北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：附錄107-116．