甘蔗葉總黃酮提取工藝及抗炎活性的研究

侯小濤， 馬麗娜， 鄧家剛*， 王禮蓉， 郝二偉， 趙超超， 劉 鵬

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021;2.廣西中藥藥效研究重點實驗室，廣西南寧530001;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530001)

甘蔗Saccharum officinarum為禾本科多年生甘蔗屬植物，我國主要分布在廣西、廣東、臺灣、福建及云南等省區(qū)［1］，其中廣西甘蔗產(chǎn)量占全國一半以上［2］，東南亞太平洋諸島國、大洋洲島嶼和古巴等地也廣為種植。甘蔗具有很高的綜合利用價值，除了作為重要制糖原料外，莖稈、稈梢與葉片還可供藥用、制酒精、養(yǎng)酵母等多種用途［1］。藥理研究表明，甘蔗葉對小鼠血糖有抑制作用［3-4］;醇提取物有較好的抑菌活性［5］，乙酸乙酯部位是體外抗腫瘤的主要活性部位［6］。甘蔗葉含有豐富的黃酮類成分，LC-MS在線測定甘蔗葉中含11種黃酮類化合物［7-8］。本實驗研究了從甘蔗葉中提取總黃酮的工藝，以優(yōu)選最佳提取方法，并采用3種炎癥模型對甘蔗葉總黃酮進(jìn)行抗炎作用的研究。

1 材料

1.1 動物 清潔級ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，均由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(桂)2009—2002。

1.2 藥物與試劑 甘蔗葉均采集于廣西甘蔗研究所28號、32號高產(chǎn)示范田，經(jīng)廣西甘蔗研究所許樹寧高級農(nóng)藝師鑒定為禾本科甘蔗屬植物甘蔗Saccharum officinarum的葉。

蘆丁 (中國藥品生物制品檢驗所)，甲醇，乙醇均為分析純，水為蒸餾水。生理鹽水 (貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司)，阿司匹林 (江蘇平光制藥有限責(zé)任公司，批號10071745)，伊文斯藍(lán) (上海源葉生物科技有限公司)，醋酸 (上海試一化學(xué)試劑有限公司)，二甲苯 (天津富宇精細(xì)化工有限公司)。

1.3 儀器 島津UV160紫外-可見分光光度計;BP211DSartorius電子天平 (北京賽多利斯天平有限公司);B3500S—MT超聲波清洗器 (必能信超聲上海有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮提取工藝研究

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取在105℃干燥下的蘆丁對照品10.40 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，搖勻，定容至刻度，即得對照品溶液。

2.1.2 最大吸收波長的選擇 采用AlCl3比色法，分別移取4.0 mL蘆丁對照品和適量甘蔗葉總黃酮提取液于25 mL量瓶中，加入1%AlCl3溶液3.0 m L，定容至刻度，搖勻，靜置20 min［9］，在200～600 nm之間進(jìn)行掃描。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.208 mg/mL)0.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL，置于25 mL量瓶，加入3.0 mL 1%的AlCl3溶液，混勻后加甲醇定容至刻度線，放置20 min。以第一個為空白，于417 nm測吸光度 (A)。以蘆丁的質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，蘆丁的質(zhì)量濃度在0.024 96～0.041 6 mg/mL線性關(guān)系良好，回歸方程為:A=2.411 1C－0.324 8，r=0.999 7。

2.1.4 甘蔗葉總黃酮提取工藝流程 甘蔗葉樣品烘箱干燥→粉碎過40目→加入乙醇→回流提取→抽濾→減壓濃縮→定容→黃酮提取液。

2.1.5 樣品總黃酮量及提取率的測定 精密吸取甘蔗葉待測液2 mL，按照1.2.2項下方法操作，測定吸光度，按照回歸方程計算提取液中的總黃酮量。

2.1.6 單因素實驗

2.1.6.1 提取溫度的考察 取5份2 g甘蔗葉細(xì)粉，每份按照固液比1∶25加入70%乙醇分別在50、60、70、80、90℃水浴中回流提取1 h，過濾，將提取液離心5 min，取其清液定容至50 mL量瓶，分別移取2.0 mL提取液，各加入1%AlCl3溶液2.0 mL，定容至10 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，分別在417 nm處測定其吸光度值為0.390、0.412、0.451、0.566、0.511。隨著溫度的升高，吸光度增加，即黃酮類化合物的提取率增加，在80℃時達(dá)到最大。然后隨著溫度的繼續(xù)升高，吸光度降低，其原因可能是溫度過高，引起黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被氧化破壞，導(dǎo)致其提取率的降低。

2.1.6.2 料液比考察 取5份2 g甘蔗葉細(xì)粉，分別按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，加入70%乙醇，在80℃水浴中回流提取1 h，過濾，將提取液離心10 min，取其清液定容至50 m L量瓶，分別移取2.0 m L提取液，各加入1%AlCl3溶液2.00 mL，定容至10 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，分別在417 nm處測定其吸光度為0.333，0.412、0.542、0.558、0.570。隨著溶劑量的增加，吸光度也有不同程度的增加。

2.1.6.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)考察 取5份2 g甘蔗葉細(xì)粉，按料液比1∶25，分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，在80℃水浴中回流提取1 h，過濾，將提取液離心10 min，取其清液定容至50 mL量瓶，分別移取2.0 mL提取液，各加入1%AlCl3溶液2.00 mL，定容至10 mL，在417 nm處按標(biāo)準(zhǔn)曲線操作測定其吸光度值，分別為0.345、0.448、0.514、0.499、0.471。開始時隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，吸光度值增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%后則有所降低。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%以上時，可能由于一些醇溶性雜質(zhì)及色素親脂性強(qiáng)的成分溶出也增多，干擾因素隨之增大，從而導(dǎo)致黃酮類化合物的提取率下降。

2.1.6.4 提取時間的考察 取5份2 g甘蔗葉細(xì)粉，按料液比1∶25，加入70%的乙醇溶液，在80℃水浴中，分別回流提取1、2、3、4、5 h過濾，將提取液離心10 min，取其清液定容至50 mL量瓶，分別移取2.00 mL提取液，各加入1%AlCl3溶液2.0 mL，定容至10 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線操作在417 nm處測定其吸光度值，分別為0.350、0.362、0.383、0.469、0.379。隨著提取時間的增加，吸光度值也隨之增加，提取率應(yīng)該是有所提高，但是超過一定的提取時間后，有可能會破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其提取率降低。

2.1.7 正交試驗

2.1.7.1 正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對本實驗影響最大的3個因素，即提取溫度 (70℃、80℃、90℃)、乙醇的體積分?jǐn)?shù) (70%、80%、90%)、料液比(1∶20、1∶25、1∶30)，提取時間 (2 h、3 h、4 h)做四因素三水平的正交試驗，以甘蔗葉中總黃酮量為評價指標(biāo)，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用L9(34)設(shè)計正交試驗，因素水平見表1。

表1 因素水平

2.1.7.2 正交試驗結(jié)果與分析 以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，每個因素取三個水平數(shù)按L9(34)設(shè)計正交試驗，確定最佳提取工藝。見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 正交試驗方差分析

根據(jù)正交實驗結(jié)果表2，各因素影響甘蔗葉總黃酮提取效果的主次順序為B＞A＞C＞D，即料液比＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時間。由表3可知，因素A、B有顯著性的差異，而因素C、D無顯著性的差異，需要結(jié)合單因素考察結(jié)果，確定最佳提取工藝為提取溫度80℃，料液比為1∶25，50%乙醇，提取時間為2 h。

2.1.8 工藝驗證 精密稱取同一批甘蔗葉細(xì)粉末2 g，平行3份，根據(jù)最佳水平組合處理:加入25倍量的50%乙醇，回流提取，在80℃下，提取2 h，過濾，分別移取2.00 mL提取液，各加入AlCl3溶液3.0 mL，定容至10 mL，搖勻，靜置20 min后，在417 nm處測量吸光度值。利用回歸方程計算出提取溶液中總黃酮的量，得到甘蔗葉總黃酮的平均量為6.77 mg/g，即1 g樣品中含6.77 mg甘蔗葉總黃酮。

2.2 甘蔗葉總黃酮抗炎作用的研究

2.2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹度的影響［10］取小鼠50只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白對照組 (生理鹽水)、陽性對照組 (阿司匹林0.2 g/kg)、高劑量組 (4 g/kg)、中劑量組 (2 g/kg)、低劑量 (1 g/kg)組。除空白組給生理鹽水外，其余各組均給予相應(yīng)的藥物，每天灌胃給藥1次，連續(xù)5 d。末次給藥45 min每只小鼠以0.02 mL二甲苯滴于右耳致炎，15 min后頸椎脫臼處死，沿耳廓基線剪下兩側(cè)耳片。用6 mm直徑打孔器分別在左、右耳同一部位打下圓耳片，稱定質(zhì)量，以左右耳片質(zhì)量差值表示腫脹程度，并計算腫脹抑制率。見表4。

抑制率=［(空白組腫脹度－給藥組腫脹度)/空白組腫脹度］×100%

表4 二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 (±s，n=8)

表4 二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 (±s，n=8)

注:與對照比較，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05

組 別 劑量/(g·kg－1) 腫脹度/mg 抑制率/%P對照組 生理鹽水24.25±5.28 －阿司匹林組 0.2 14.25±5.78 41.23 ＊＊甘蔗葉總黃酮低劑量組 1 17.5±5.55 27.83 *甘蔗葉總黃酮中劑量組 2 15.88±5.17 33.15 *甘蔗葉總黃酮高劑量組 4 15.12±5.51 36.41＊＊

由表4可知，甘蔗葉總黃酮1 g/kg、2 g/kg組與對照組相比，小鼠耳廓腫脹程度顯著下降 (P＜0.05)，4 g/kg組與對照組相比，小鼠耳廓腫脹程度極顯著下降 (P＜0.01)，說明甘蔗葉總黃酮能顯著抑制二甲苯致小鼠耳腫脹。

2.2.2 對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響［10］取小鼠50只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白對照組 (生理鹽水)、陽性對照組 (阿司匹林0.2 g/kg)、高劑量組 (4 g/kg)、中劑量組 (2 g/kg)、低劑量(1 g/kg)組。除空白組給生理鹽水外，其余各組均給予相應(yīng)的藥物，每天灌胃給藥1次，給藥容量0.2 mL/10 g，連續(xù)5 d。末次給藥后45 min每只小鼠尾靜脈注射0.25%伊文斯藍(lán)-生理鹽水0.1 mL/10 g，同時腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只。15 min后，脫頸椎處死小鼠，立即注入6 mL生理鹽水沖洗腹腔，剪開腹腔，濾出腹腔洗出液，離心(2 000 r/min，10 min)，取上清液于590 nm處測定OD值，以A值判斷小鼠腹腔毛細(xì)血管的通透性。見表5。

抑制率=［(空白組OD值－給藥組OD值)/空白組OD值］×100%

由表5可知，甘蔗葉總黃酮1、2、4 g/kg組與對照組相比，伊文思藍(lán)滲出量顯著下降 (P＜0.05)，說明甘蔗葉總黃酮能顯著抑制醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性增加。

表5 小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 (±s，n=10)

表5 小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 (±s，n=10)

注:與對照組比較，*P＜0.05

組 別 劑量/(g·kg－1)OD值 抑制率/%對照組 生理鹽水0.343±0.094 －阿司匹林組 0.2 0.233±0.0287 32.07甘蔗葉總黃酮低劑量組 1 0.264±0.050 23.03甘蔗葉總黃酮中劑量組 2 0.262±0.033 23.61甘蔗葉總黃酮高劑量組 4 0.257±0.027 25.07

2.2.3 對小鼠棉球肉芽腫形成的影響［10］小鼠50只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，乙醚麻醉，在各鼠的背部正中央去毛并用75%的乙醇消毒，然后用手術(shù)剪刀開0.5 cm長的小口，用眼科鑷子將己精密稱為10 mg的滅菌棉球從小切口植入皮下，之后用手術(shù)針縫合小鼠皮膚。然后隨機(jī)分成5組，按2.2項給藥劑量給藥，從手術(shù)當(dāng)天開始，灌胃給藥每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥后5 h脫頸處死小鼠，用剪刀和鑷子打開原切口，將棉球連同周圍結(jié)締增生組織一起取出，剔除脂肪組織，放入烘箱中60℃烤至恒定質(zhì)量，稱定質(zhì)量 (mg)。將稱得的質(zhì)量減去棉球原質(zhì)量即得肉芽腫的質(zhì)量，計算肉芽腫脹抑制率。見表6。

肉芽腫脹抑制率=［(對照組平均肉芽腫質(zhì)量－給藥組平均肉芽腫質(zhì)量)/對照組平均肉芽腫質(zhì)量］×100%

表6 小鼠棉球肉芽腫形成的影響 (±s，n=10)

表6 小鼠棉球肉芽腫形成的影響 (±s，n=10)

注:與對照組比較，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05

組 別 劑量/(g·kg－1)肉芽腫質(zhì)量/mg 抑制率/%P對照組 生理鹽水35.5±5.928 －阿司匹林組 0.2 22.75±4.928 35.91 ＊＊甘蔗葉總黃酮低劑量組 1 31.123±5.640 12.33甘蔗葉總黃酮中劑量組 2 29.75±5.884 16.2 *甘蔗葉總黃酮高劑量組 4 27.125±5.503 23.59*

實驗結(jié)果顯示甘蔗葉連續(xù)灌胃7 d能抑制小鼠棉球肉芽腫的形成，與空白對照組比較，差異顯著。其中低劑量組有作用趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

測定總黃酮時，常選擇顯色系統(tǒng)NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色測定總黃酮的量，在此條件下，選擇蘆丁做對照品，在510 nm處對照品有吸收峰，但樣品溶液沒有吸收峰;因此，更換顯色劑，選擇AlC13溶液作為顯色劑，200～800 nm掃描，結(jié)果對照品溶液與樣品溶液在417 nm處有最大吸收峰，因此選用蘆丁為對照品，顯色劑為三氯化鋁溶液。三氯化鋁顯色分光光度法測定中藥中總黃酮的量，是根據(jù)黃酮類化合物分子中含有的3-羥基、4-羰基或5-羥基、4-羰基或鄰二酚羥基可以與鋁鹽定量結(jié)合，形成有色絡(luò)合物的原理，通過測定有色絡(luò)合物的吸光度，來測定中藥中總黃酮含量的方法［9］?；瘜W(xué)成分研究表明［7-8］，甘蔗葉中含有的黃酮苷類成分符合以上結(jié)構(gòu)特征，因此，可用三氯化鋁顯色分光光度法測定總黃酮的量。

關(guān)于提取方法的選擇，在前期中比較了回流法、超聲法、浸漬法的提取效率，結(jié)果表明用回流法的提取效率最佳;通過對不同提取溶劑甲醇-水、乙醇-水的考察，結(jié)果表明用乙醇-水的提取效率最佳，故本研究在此基礎(chǔ)上，利用正交試驗法對甘蔗葉總黃酮的提取工藝進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果顯示最佳提取工藝為提取溫度為80℃，料液比為1∶25，提取乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時間為2 h。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥滲出和腫脹模型中，甘蔗葉總黃酮能顯著抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹 (抑制率分別為27.83%、33.15%、36.41%)、顯著拮抗醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高 (抑制率分別為23.03%、23.61%、25.07%)，中、高劑量均能顯著抑制小鼠棉球肉芽腫 (抑制率分別為16.2%、23.59%)。實驗表明，甘蔗葉總黃酮有抗炎作用，但是對于抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn):

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