抗乳增片對乳腺增生癥大鼠T細胞亞群及免疫分子的影響

周 會， 汪天明， 王 靚， 胡海霞， 白 玫

(安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合臨床學院，安徽合肥230038)

現(xiàn)代研究表明，乳腺增生癥除了表現(xiàn)為內(nèi)分泌激素失調(diào)外，還可表現(xiàn)為免疫分子及免疫細胞等含量及功能的異常。神經(jīng)、免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)在維護機體內(nèi)環(huán)境的平衡中相互協(xié)調(diào)，組成信息分子相互調(diào)節(jié)的統(tǒng)一整體［1-2］。本實驗通過復制大鼠乳腺增生模型，考察抗乳增片對乳腺增生癥大鼠免疫系統(tǒng)的影響，進一步探討抗乳增片對大鼠乳腺增生的治療機理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 普通級SD雌性未孕大鼠36只，體質(zhì)量(250±16)g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物研究中心提供。

1.2 實驗藥物 抗乳增片:安徽醫(yī)藥研究所提供;主要藥物:丹參、玄參、紅花、柴胡、香附、當歸、夏枯草、生牡蠣、山慈菇、海藻等。逍遙丸:湖南九芝堂股份有限公司，批號:090560;苯甲酸雌二醇注射液:上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號:030402;紅細胞裂解液由美國kegene公司提供;流式細胞儀:EPICSELITE(美國B-C公司)。IL-2，TNF-α試劑盒購于解放軍總醫(yī)院東亞免疫所;T細胞亞群試劑盒購于北京博奧森生物技術有限公司 (抗體:PE標記的小鼠抗大鼠CD4+抗體，TC標記的小鼠抗大鼠CD8+抗體，F(xiàn)ITC標記的小鼠抗大鼠CD3+抗體，以上抗體原產(chǎn)于美國CALTAG公司)。

2 實驗方法

2.1 大鼠乳腺增生模型的制備 SD雌性未孕大鼠36只，隨機分為6組:假手術組、模型對照組、陽性對照組和抗乳增片大、中、小劑量組。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，劑量為0.3 mL/100 g體質(zhì)量。假手術組的大鼠不摘除卵巢，打開腹腔后重新縫合;其余各組的大鼠均摘除兩側卵巢。除了假手術組以外，其余各組大鼠于手術后第2天起隔天腹腔注射苯甲酸雌二醇 (劑量為0.3 mg/kg體質(zhì)量)，連續(xù)15次，制造乳腺增生模型［3］。

2.2 給藥 造模后假手術組和模型組給予蒸餾水，灌胃。給藥組給藥容積均為10 mL/kg;抗乳增片大、中、小劑量組給予抗乳增片，劑量分別為2.34、0.78、0.26 g/kg體質(zhì)量;陽性對照組給予逍遙丸，劑量為2.28 g/kg體質(zhì)量。以上給藥連續(xù)4周，每日1次。

2.3 觀察指標 給藥4周后，腹主動脈放血處死大鼠。留取血液5 mL，2 mL立即離心 (3 000 r/min，5 min)制備血清，用放射免疫方法測定各組實驗性大鼠血清中IL-2和TNF-α的水平［3］。其余用于檢測T細胞亞群，取100μL血液置于EDTANa2抗凝管中，加入CD3+抗體、CD4+抗體和CD8+抗體。室溫下避光孵育30 min，加紅細胞裂解液3 mL，放置10 min后，1 500 r/min離心10 min，棄去上清液。PBS洗滌，1 500 r/min離心10 min，棄去上清液，上流式細胞儀檢測T細胞亞群［4］。

3 實驗結果

3.1 抗乳增片對大鼠血清中IL-2和TNF的影響 如表1，模型組大鼠血清中的TNF-α顯著高于假手術組，IL-2卻低于假手術組 (P＜0.05)。經(jīng)抗乳增片治療組各鼠血清中IL-2顯著高于模型組而TNF-α顯著降低 (P＜0.05)。各劑量組之間的上述兩項指標無顯著差異 (P＞0.05)。

表1 抗乳增片對大鼠血清中IL-2和TNF-α的影響 (±s，n=6)

表1 抗乳增片對大鼠血清中IL-2和TNF-α的影響 (±s，n=6)

注:與模型組相比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分組 劑量/(g·kg－1)IL-2/(ng·mL－1)TNF-α/(ng·mL－1)假手術組 0.29±0.10＊＊ 1.58±0.26＊＊模型組 / 0.16±0.08 1.99±0.36抗乳增片大劑量組 2.34 0.32±0.09＊＊ 1.47±0.21*抗乳增片中劑量組 0.78 0.42±0.12＊＊ 1.48±0.03*抗乳增片小劑量組 0.26 0.31±0.07* 1.56±0.42逍遙丸組 2.28 0.27±0.07＊＊ 1.10±0.36＊＊

3.2 抗乳增片對大鼠外周血中T細胞亞群的影響 流式細胞儀檢測模型對照組大鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+顯著低于假手術組(P＜0.05)，CD8+較假手術組稍高但無顯著性差異?？谷樵銎委熃MCD3+、CD4+、CD4+/CD8+等指標有所提高，尤其是大劑量組上述指標與模型對照組有極顯著差異 (P＜0.01)，抗乳增片中劑量組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+等指標較模型組亦有所上調(diào)(P＜0.05)(見表2)。

表2 抗乳增片對大鼠血清中T細胞亞群的影響 (±s，n=6)

表2 抗乳增片對大鼠血清中T細胞亞群的影響 (±s，n=6)

注:與模型組相比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分 組 劑量/(g·kg－1) CD3+/% CD4+/% CD8+/% (CD4+/CD8+)假手術組 / 61.67±14．66* 32.70±4.77* 22.59±4.66 1.53±0.50*模型組 / 48.46±13．77 24.27±6.39 24.58±2.05 1.00±0.30抗乳增片大劑量組 2.34 63.94±10．30＊＊ 37.61±8.01＊＊ 32.27±4.41＊＊ 1.18±0.29抗乳增片中劑量組 0.78 63.79±6．48* 36.67±4.05＊＊ 26.12±4.85 1.44±0.03*抗乳增片小劑量組 0.26 59.71±5．53 30.25±3.30* 26.11±4.46 1.16±0.11逍遙丸組 2.28 59.48±10．62 33.26±6.79*27.78±8.63 1.31±0.54

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為乳腺增生的發(fā)病是內(nèi)分泌的紊亂所引起，雌二醇分泌絕對或相對過高，孕酮水平低，以致月經(jīng)周期中乳腺組織增生和復舊過程發(fā)生紊亂，使乳腺導管或腺泡上皮增生，乳管擴張成囊狀，形成腫塊［5-7］。研究表明T淋巴細胞是性激素的主要靶器官，雌二醇、孕酮分泌紊亂可導致機體自體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡系統(tǒng)呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)及免疫調(diào)節(jié)功能的紊亂，出現(xiàn)免疫功能降低，免疫系統(tǒng)不能有效的識別、抑制和清除病變細胞而導致本病的發(fā)生。正常機體內(nèi)體內(nèi)CD3+(T輔助細胞)、CD4+(T抑制)細胞維持一定的比例，各淋巴細胞亞群相互作用，維持機體正常的免疫功能［8-9］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，乳腺增生患者體內(nèi)CD3+、CD4+水平稍低于正常值、CD4+/CD8+顯著低于正常值［10］。本實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠CD4+/CD8+值降低顯著，CD3+、CD4+T細胞百分數(shù)亦有不同程度降低。CD4+/CD8+值發(fā)生改變說明乳腺增生模型大鼠淋巴細胞及其亞群在變化之中，機體免疫功能發(fā)生了紊亂，與報道一致。經(jīng)抗乳增片治療的大鼠血清CD4+/CD8+值明顯上調(diào)，CD3+、CD4+T細胞百分數(shù)亦有所提高。

臨床研究也發(fā)現(xiàn)乳腺增生病患者免疫功能失調(diào)，與免疫相關的細胞因子如IL-2，TNF等參與機體的免疫調(diào)節(jié)。IL-2是由活化的TH1細胞或CD4+細胞產(chǎn)生，主要通過自分泌方式促進T細胞生長，可誘導殺傷異常增生細胞;TNF-α具有抗感染、抗病毒和抗腫瘤的作用［11］。本研究中模型組大鼠血清中的 TNF-α顯著高于假手術組 (P＜0.05)，IL-2卻低于假手術組 (P＜0.05)。經(jīng)抗乳增片治療組各鼠血清中IL-2顯著高于模型組而TNF-α顯著降低。表明抗乳增片能夠促進IL-2生成，抑制TNF-α的合成，對大鼠免疫系統(tǒng)具有一定的調(diào)節(jié)作用。

現(xiàn)代研究證實柴胡、香附、當歸等具有疏肝解郁、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強機體免疫功能的作用，王桐生等報道香附可顯著提高小鼠吞噬指數(shù)，脾臟胸腺指數(shù)，增加脾臟淋巴細胞的增殖活化［12］。夏枯草、生牡蠣、山慈菇、海藻等則著重散結化痰通絡。紅花、丹參等中藥可活血祛瘀、調(diào)節(jié)免疫，抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗腫瘤等作用。通過本實驗研究提示抗乳增片解郁散結，調(diào)節(jié)免疫之功，可能是通過調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群及IL-2、TNF-α等免疫分子的水平而實現(xiàn)的。對抗乳增片的前期的實驗研究中也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠，脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)較假手術組均降低，抗乳增片治療組的脾臟、胸腺等免疫器官臟器指數(shù)顯著升高［13］?？谷樵銎苡行岣呷橄僭錾笫蟮拿庖吖δ埽@可能是其抑制大鼠乳腺組織病變的另一機理。

［1］王 非，吳開明．中醫(yī)對乳腺增生病的認識及實驗研究概況［J］．時珍國醫(yī)國藥，2008，19(3):622-623．

［2］馬秀琴，陳如華，劉秀芳．匹多莫德口服液對急性加重期慢性阻塞性肺病患者細胞免疫的影響［J］．貴陽醫(yī)學院學報，2011，36(6):589-591．

［3］周 會，龍子江，陳 明，等．抗乳增片對乳腺增生模型大鼠乳腺的影響［J］．中成藥，2008，30(10):1536-1538．

［4］李彩霞，曾 星，黃 羽，等．豬苓及豬苓多糖對BBN誘導的膀胱癌大鼠外周血T淋巴細胞亞群表達的影響［J］．中藥新藥與臨床藥理，2010，21(6):573-576．

［5］劉錚然，張 東，楊玉梅，等．乳塊消軟膠囊對實驗性乳腺增生大鼠的影響［J］．包頭醫(yī)學院學報，2011，27(1):3-4．

［6］余成浩，李文軍，王 帥，等．復方美登木片防治大鼠乳腺增生的研究［J］．中藥藥理與臨床，2012，28(2):137-139．

［7］邢松麗，羅 小，劉 凱．刮痧及中藥對乳腺增生病大鼠血清性激素研究的影響［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(7):1950-1952．

［8］曹 暉，劉麗芳，祁 林，等．乳增寧膏對乳腺增生病模型大鼠內(nèi)分泌激素及免疫功能的影響［J］．中國醫(yī)藥指南2010，8(9):57-60．

［9］馬 瓊，杜 麗，崔玉芳，等．慢性長期微波輻射對大鼠外周血T、B淋巴細胞亞群的影響［J］．解放軍醫(yī)學雜志，2010，35(1):1302-1305．

［10］張麗芬，宋阿鳳，王志華．調(diào)腎疏肝針法對乳腺增生患者內(nèi)分泌、免疫功能的影響［J］．中國針灸，2008，28(9):648-652．

［11］陳 楓，袁婉麗，張岱權，等．分時針刺膽經(jīng)穴位對卵巢缺失大鼠TNF、IL以及T淋巴細胞亞群的影響［J］．中國免疫學雜志，2011，27(6):518-520．

［12］王桐生，王 靚，施伶俐，等．香附理氣顆粒對小鼠免疫功能影響的實驗研究［J］．中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2010，12(2):30-32．

［13］周 會，龍子江，王 靚，等．抗乳增片對乳腺增生模型大鼠臟器系數(shù)及乳腺組織ER，PR表達的影響［J］．實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2009，23(8):22-26．