回乳抑增一號(hào)對(duì)高泌乳素血癥大鼠血清泌乳素水平和乳腺組織形態(tài)學(xué)的實(shí)驗(yàn)觀察

王 雄， 陳永剛， 劉新國(guó)， 李居怡， 鄒吉利， 吳金虎

(武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢430060)

高泌乳素血癥 (Hyperprolactinemia)，是一種常見(jiàn)的下丘腦-垂體-性腺軸疾患，是由于多種因素引起垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌過(guò)多的泌乳素 (＞25 ng/mL)所致，大部分為女性發(fā)病，臨床上以溢乳、閉經(jīng)、月經(jīng)稀少及不孕等癥狀常見(jiàn)［1］。高泌乳素血癥的發(fā)生與體內(nèi)泌乳素、雌激素、孕激素等水平異常有關(guān)，部分高泌乳素血癥患者伴有乳腺增生癥狀。目前治療高泌乳素血癥的藥物主要是進(jìn)口藥溴隱亭等，但其存在價(jià)格昂貴、副作用大等特點(diǎn)，患者依從性很差，很難堅(jiān)持治療。中醫(yī)藥在治療高泌乳素血癥方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，尤其是中藥復(fù)方治療該病取得了滿意的療效［2］?；厝橐衷鲆惶?hào)是我院應(yīng)用多年的院內(nèi)制劑，由麥芽、牡蠣、浙川貝、夏枯草、白芥子、山慈姑、淡昆布、郁金、玄參、丹參等組成，具有回乳消脹、軟堅(jiān)散結(jié)等功效，治療婦女溢乳，臨床應(yīng)用療效顯著。本研究采用大鼠高泌乳素血癥模型，觀察其對(duì)大鼠高泌乳素血癥的治療作用，探討其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用及新藥開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 雌性未孕Wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)SCXK(鄂)2008-0005。

1.2 儀器與試藥 雌二醇、孕酮、泌乳素、促卵泡激素、促黃體生成素ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒 (上海麗臣生物有限公司，批號(hào):08/2011)，恒溫箱 (武漢大江電器儀表廠)，酶標(biāo)儀 (深圳雷杜Rayto RT—6000)，全自動(dòng)雷杜Rayto洗板機(jī) (RT—3100)。

甲磺酸溴隱亭:Novartis Pharma Schweiz AG生產(chǎn)，批號(hào):10080;鹽酸甲氧氯普胺注射液 (徐州萊恩藥業(yè)有限公司，批號(hào):1006131)。回乳抑增一號(hào)處方組成:麥芽120 g、夏枯草20 g、玄參5 g、浙川貝10 g、郁金10 g、丹參10 g、白芥子8 g、淡昆布5 g、牡蠣10 g、山慈姑3 g，藥材由湖北清大藥業(yè)公司提供，經(jīng)武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部吳金虎教授鑒定，各藥材品種均符合2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定。復(fù)方制備方法:藥材加8倍量的水浸泡60 min，用武火煮沸15 min，后用文火煮30 min，取煎液。藥渣再用8倍量的水重復(fù)煎煮1次。兩次煎液合并，濾過(guò)，濃縮至2.51 g/mL(每1 mL藥液相當(dāng)于2.51 g生藥量)，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備 參考文獻(xiàn)方法［3］并加以改進(jìn)，在大鼠背部皮下按50 mg/kg體質(zhì)量的劑量注射鹽酸甲氧氯普胺注射液(滅吐靈)，每天9∶00和16∶00分別注射1次，連續(xù)5 d。

2.2 分組與給藥 60只大鼠隨機(jī)分為6組:正常組、模型組、溴隱亭陽(yáng)性藥組、回乳抑增一號(hào)低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，除正常組外，其他組別大鼠均制備成疾病模型，模型制備后給藥。用藥劑量根據(jù)人和動(dòng)物體表面積與劑量換算［4］。陽(yáng)性藥組給溴隱亭，劑量為0.393 mg/(kg·d);回乳抑增一號(hào)高劑量組給予回乳抑增一號(hào)湯劑，劑量為33.1 g/(kg·d)(人臨床劑量的11倍);回乳抑增一號(hào)中劑量組給予回乳抑增一號(hào)湯劑，劑量為16.55 g/(kg·d)(人臨床劑量的5.5倍);回乳抑增一號(hào)低劑量組給予回乳抑增一號(hào)湯劑，劑量為8.28 g/(kg·d)(人臨床劑量的2.75倍)。正常組和模型組給等容量的蒸餾水。各組動(dòng)物在造模成功后，胃飼相應(yīng)藥物或蒸餾水，每日1次，每次2 mL，連續(xù)30 d。

2.3 樣品采集 末次給藥24 h后，所有動(dòng)物禁食12 h，自由飲水。于次日上午8∶00～10∶00取血。取血方法為眼球摘除法:倒持固定大鼠，按住頸部，使眼球突出;以小止血鉗迅速鉗取眼球，眼眶內(nèi)很快流出血液;同時(shí)作規(guī)律性松緊擠壓胸腔，以促使血液流出;血液以3 000 r/min的速度離心5 min，取上清液供檢測(cè)。

所有大鼠處死后，取第2對(duì)乳腺組織，用10%甲醛溶液充分固定24 h，標(biāo)本取材后，放入生物組織自動(dòng)脫水機(jī)內(nèi)脫水，浸蠟后，在生物組織包埋機(jī)內(nèi)包埋。每組組織蠟塊在切片機(jī)上連續(xù)切片3張，切成4μm厚度。

2.4 樣品檢測(cè)

2.4.1 動(dòng)物一般活動(dòng)觀察 觀察正常組、造模組和各給藥組大鼠的一般活動(dòng)情況。

2.4.2 大鼠血清激素檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫分析方法檢測(cè)各組大鼠血清中雌二醇、孕酮、泌乳素、促卵泡激素、促黃體生成素的水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)中實(shí)驗(yàn)操作流程進(jìn)行。

2.4.3 大鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)檢查 大鼠乳腺組織經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察各組大鼠乳腺組織情況，包括腺泡、小葉是否增生，導(dǎo)管形狀及厚度，以及是否出現(xiàn)分泌物。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)動(dòng)物一般活動(dòng)的影響 正常組大鼠飲食、飲水正常，糞粒正常，不帶黏液;眼睛鮮紅有精神，運(yùn)動(dòng)快速有力。造模后大鼠飲食、飲水量減少、大便稀;眼睛無(wú)神欲閉，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，行動(dòng)遲緩，夜間自主活動(dòng)減少。陽(yáng)性藥溴隱亭組大鼠治療后，飲食、飲水有所改善，行動(dòng)仍然遲緩?；厝橐衷鲆惶?hào)高、中劑量組大鼠飲食、飲水量佳、糞粒正常;毛發(fā)潤(rùn)澤、眼睛鮮紅有精神，活動(dòng)靈敏?；厝橐衷鲆惶?hào)低劑量組大鼠飲食、飲水量好轉(zhuǎn)，精神不佳。

3.2 對(duì)大鼠血清激素水平的影響 由表1可見(jiàn)，與正常組比較，模型組大鼠血清泌乳素水平明顯升高 (P＜0.05)，雌二醇、孕酮、促卵泡激素和促黃體生成素值明顯下降(P＜0.05)。與疾病模型組相比，回乳抑增一號(hào)高劑量組和中劑量組大鼠血清泌乳素水平明顯下降，有顯著差異(P＜0.05)，且高劑量組接近正常組水平，療效與溴隱亭相當(dāng)?；厝橐衷鲆惶?hào)中劑量組與模型組相比，雌二醇、孕酮、促卵泡激素和促黃體生成素水平顯著提高，均接近正常組水平，治療效果最好?；厝橐衷鲆惶?hào)低劑量組無(wú)明顯效果。

3.3 對(duì)大鼠乳腺組織病理形態(tài)的影響 乳腺增生根據(jù)病理增生狀況分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 5個(gè)等級(jí)［5］，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

顯微鏡下觀察可見(jiàn)，正常組大鼠乳腺小葉不增生，腺體數(shù)量極少，腺泡和導(dǎo)管無(wú)增生、擴(kuò)張，無(wú)分泌物，處于靜止?fàn)顟B(tài) (見(jiàn)圖1A);高泌乳素血癥模型大鼠均發(fā)現(xiàn)乳腺小葉部分增生，個(gè)別腺泡和導(dǎo)管輕度增生，存在少量分泌物，出現(xiàn)輕度乳腺增生 (Ⅰ級(jí)或Ⅱ級(jí)增生)(見(jiàn)圖1B和1C);溴隱亭陽(yáng)性藥組大鼠乳腺腺泡及小葉部分增生，導(dǎo)管擴(kuò)張，可見(jiàn)分枝，腔內(nèi)有少許分泌物 (見(jiàn)圖1D);回乳抑增一號(hào)高、中劑量組大鼠乳腺腺泡恢復(fù)正常，分布均勻，大多數(shù)導(dǎo)管細(xì)長(zhǎng)，分枝少，無(wú)分泌物 (見(jiàn)圖1E和1F);回乳抑增一號(hào)低劑量組大鼠乳腺小葉部分增生個(gè)別腺泡和導(dǎo)管輕度增生，存在分泌物 (見(jiàn)圖1G)。

表1 回乳抑增一號(hào)對(duì)高泌乳素血癥大鼠雌二醇、孕酮、泌乳素、促卵泡激素、促黃體生成素水平的影響 (n=10)

表2 乳腺組織病理增生狀況分級(jí)

圖1 各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)圖 (HE×200)

對(duì)每只大鼠的乳腺增生狀況按表2標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，結(jié)果經(jīng)Ridit檢驗(yàn)，陽(yáng)性藥溴隱亭組、回乳抑增一號(hào)高和中劑量組與模型組比較有顯著性差異 (P＜0.05)，有明顯的治療作用，見(jiàn)表3。

表3 回乳抑增一號(hào)對(duì)高泌乳素血癥大鼠乳腺組織病理形態(tài)的影響

4 討論

目前，制備高泌乳素血癥的動(dòng)物模型方法的報(bào)道很多，如灌胃己烯雌酚片［6］、滅吐靈腹腔注射模型［7］、異體垂體前葉植入模型［8］、氟哌啶醇皮下注射模型［9］、滅吐靈皮下注射模型［10］等。滅吐靈能阻斷下丘腦多巴胺受體，抑制催乳素抑制因子，促進(jìn)泌乳素的分泌。己烯雌酚作為雌性激素類避孕藥，也是一種多巴胺受體拮抗劑類藥物。本實(shí)驗(yàn)對(duì)造模方法進(jìn)行了重復(fù)和摸索，發(fā)現(xiàn)滅吐靈腹腔注射的方法重復(fù)率不高，個(gè)體差異大;灌胃己烯雌酚片的方法所需周期長(zhǎng);異體垂體前葉植入模型的方法過(guò)于復(fù)雜，難度較大。最終，發(fā)現(xiàn)皮下注射滅吐靈造模，具有造模時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、成功率高等優(yōu)點(diǎn)。所選造模動(dòng)物種類也很多，主要有大鼠、小鼠、兔等，以大鼠最為常用。故采用大鼠背部皮下注射滅吐靈的方法制備高泌乳素血癥模型，實(shí)驗(yàn)證實(shí)其造模時(shí)間短，成功率高。

高泌乳素血癥屬中醫(yī)的“閉經(jīng)”、 “乳泣”、 “月經(jīng)過(guò)少”、“不孕”等范疇，常見(jiàn)病因?yàn)楦斡魵鉁蚋斡艋?、肝火上?或腎虛肝郁或肝腎不足致沖任失養(yǎng)，封藏失職;或脾虛痰阻，統(tǒng)攝無(wú)權(quán)，氣血紊亂［11］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷高泌乳素血癥主要根據(jù)血清激素的檢測(cè)，泌乳素＞25 ng/mL、雌二醇、孕酮、促卵泡激素和促黃體生成素的降低為其特異性指標(biāo)。血清泌乳素濃度的增高會(huì)擾亂下丘腦-垂體-性腺軸的功能，使下丘腦促性腺激素釋放激素 (GnRH)合成和分泌受阻，并減弱了垂體對(duì)GnRH的敏感性，導(dǎo)致促卵泡激素分泌低下，進(jìn)而卵巢分泌的雌二醇、孕酮不足，造成卵泡發(fā)育不良和黃體功能不足而致月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)和不孕等［12］。同時(shí)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高泌乳素血癥大鼠均出現(xiàn)輕度乳腺增生，乳腺小葉部分增生，個(gè)別腺泡和導(dǎo)管輕度增生，存在少量分泌物等。這和臨床上報(bào)道的部分高泌乳素血癥患者伴有乳腺增生癥狀相一致，說(shuō)明高泌乳素血癥和乳腺增生密切相關(guān)，泌乳素的升高可促進(jìn)乳腺增生的發(fā)生。目前科學(xué)界主要認(rèn)為乳腺增生的發(fā)生與雌二醇和孕酮有直接的關(guān)系［13］，而忽視了泌乳素對(duì)乳腺增生的影響。近年來(lái)越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道泌乳素對(duì)乳腺增生的作用，所以今后在臨床中應(yīng)該增加對(duì)泌乳素的檢測(cè)，重視泌乳素與乳腺增生的關(guān)系，有助于深入研究乳腺增生的發(fā)病機(jī)制。

中藥復(fù)方能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌平衡，在治療高泌乳素血癥方面優(yōu)勢(shì)突出。回乳抑增一號(hào)方中重用生麥芽以回乳消脹，夏枯草入肝經(jīng)能消腫散結(jié)同為君藥;佐以玄參、浙貝母清熱散結(jié)，以助夏枯草散結(jié)之功，郁金能活血行氣而開(kāi)郁止痛，丹參善活血散結(jié)調(diào)經(jīng)止痛，共助麥芽疏肝消脹，四味同為臣藥。白芥子利氣散結(jié)通絡(luò)止痛，昆布消痰散結(jié)，牡蠣軟堅(jiān)散結(jié)，山慈菇解毒消癰散結(jié)，俱為佐藥。全方配伍，回乳、散結(jié)、疏肝、止痛之法具備，直達(dá)肝經(jīng)，共奏回乳消脹，軟堅(jiān)散結(jié)，化痰通絡(luò)，行氣活血之功效?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)［10］，麥芽中含有類似溴隱亭樣物質(zhì)，具有擬多巴胺激動(dòng)劑的作用，其水提物治療高泌乳素血癥效果顯著。

回乳抑增一號(hào)能顯著降低高泌乳素血癥患者過(guò)高的泌乳素，調(diào)節(jié)機(jī)體下丘腦-垂體-性腺軸的平衡，改善卵巢功能，恢復(fù)卵泡和黃體功能，恢復(fù)雌二醇、孕酮、促卵泡激素和促黃體生成素的正常水平，達(dá)到治愈由高泌乳素血癥引起的溢乳、月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)和不孕等疾病的目的。同時(shí)，其也能顯著改善高泌乳素血癥引起的乳腺增生癥狀。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，其療效確切，與溴隱亭有相似療效，且無(wú)毒副作用，為中醫(yī)臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。不過(guò)，今后的研究還要側(cè)重于回乳抑增一號(hào)治療高泌乳素血癥的組方優(yōu)化研究，因方中藥味較多，以及使用藥量很大，如何優(yōu)化配伍使其療效達(dá)到最佳，是下一步的工作目標(biāo)。

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