HPLC法同時(shí)測(cè)定合歡花中3種黃酮類成分

王 萌， 郭偉英

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州121000)

合歡花為豆科植物合歡Albizzia julibrissin Durazz的干燥花序，為常用中藥，合歡花具解郁安神之功效，常用于心神不安，憂郁失眠［1］。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，合歡花的水煎液［2］及其所含的槲皮苷、異槲皮苷均有較強(qiáng)的鎮(zhèn)靜催眠作用［3］;合歡花水提物對(duì)“行為絕望”動(dòng)物模型有明顯抗抑郁作用［4］。其主要化學(xué)成分為槲皮苷、槲皮素、異槲皮苷、蘆丁、山柰酚和異鼠李素等黃酮類化合物［5-7］?！吨袊?guó)藥典》2010年版只對(duì)合歡花中的槲皮苷成分進(jìn)行了定量測(cè)定，在目前已有的文獻(xiàn)報(bào)道中，有人采用紫外分光光度法測(cè)定合歡花中總黃酮的量［8］、RP-HPLC 測(cè)定合歡花中槲皮苷的量［9-12］及HPLC測(cè)定合歡花中槲皮素的量［13］，但未見同時(shí)測(cè)定合歡花中異槲皮苷、槲皮苷和槲皮素3種黃酮類的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定了合歡花中異槲皮苷、槲皮苷和槲皮素的量，以期為合歡花的質(zhì)量控制提供一定依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 日立 L—2000系列高效液相色譜儀(日本高新技術(shù)集團(tuán));AL—204型精密電子天平［梅特勒-托利多 (上海)有限公司］;KQ—100A型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);pHS—3C型酸度計(jì) (上海偉業(yè)儀器廠)。

1.2 試劑 異槲皮苷對(duì)照品 (批號(hào)11121801，純度≥98%)、槲皮苷對(duì)照品 (批號(hào)11122102，純度≥98%)及槲皮素對(duì)照品 (批號(hào)12072505，純度為98.13%)均為成都曼斯特生物科技有限公司提供;合歡花分別購(gòu)自8個(gè)地區(qū)某藥房 (吉林長(zhǎng)春20120730;吉林永吉 20120813;遼寧錦州20120901;遼寧大連 20120830;河北廊坊20120808;河北保定 20120815;陜西西安20121101;陜西榆林20121019)，藥材均由遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院郭偉英教授鑒定實(shí)為豆科植物合歡Albizzia julibrissin Durazz的干燥花序;甲醇、磷酸為色譜純，乙醇為分析純，水為自制三蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil BDS色譜柱 (200 mm×4.6 mm，5μm)，大連依利特科學(xué)儀器有限公司;流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液 (34∶66);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm;柱溫35℃;進(jìn)樣量10μL。按上述色譜條件下，異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素與樣品中其他成分均能達(dá)到完全分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不小于3 000。見圖1。

圖1 對(duì)照品 (A)、供試品溶液 (B)的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sam ple solution(B)

2.2 混合對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取對(duì)照品異槲皮苷8.9 mg，槲皮苷15.15 mg，槲皮素6.6 mg于25 mL量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為0.356、0.606、0.264 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制 精密稱取合歡花粉末(遼寧錦州)2.0 g，至具塞錐形瓶中，加90%乙醇40 mL溶解，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷后用90%乙醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，用濾紙濾去殘?jiān)∩锨逡?，即得合歡花藥材供試品溶液。進(jìn)樣前，用0.45μm微孔濾膜過濾。

2.4 線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品溶液0.2、0.5、2.5、5、7.5 mL，分別置10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻。分別精密吸取各混合溶液及原混合溶液10μL進(jìn)樣分析，以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到異槲皮苷、槲皮苷和槲皮素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為:Y=1.31×107X+6.97×103，r=0.999 8(n=6);Y=1.39×107X+4.15×103，r=0.999 8(n=6);Y=1.16×107X－2.87×104，r=0.999 7(n=6)。線性范圍分別為7.12～356 μg/mL、12.12～606 μg/mL、5.28～264μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，得到異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD(n=6)分別為0.86%、0.70%、0.90%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液進(jìn)樣10 μL，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)得異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD(n=5)分別為1.21%、0.94%、1.80%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品 (遼寧錦州)6份，精密稱定，按2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL，得到異槲皮苷、槲皮苷和槲皮素的含有量平均值分別為 0.755 mg/g、8.537 mg/g、0.191 mg/g，RSD(n=6)分別為1.11%、0.83%、1.42%。表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含有量的合歡花粉末 (遼寧錦州)約1.0 g，共9份，每3份為一組，每組分別精密加入異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素對(duì)照品溶液適量，制成低、中、高質(zhì)量濃度的溶液，按2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，進(jìn)樣量為10μL。計(jì)算加樣回收率和RSD，見表1。結(jié)果異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素平均回收率 (n=9)為96.2%、100.1%、96.7%。

2.9 樣品測(cè)定 購(gòu)自8個(gè)不同產(chǎn)地的合歡花藥材，分別按2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，每份溶液進(jìn)樣3次，按外標(biāo)法計(jì)算異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素的量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=3)Tab.2 Results of content determination of sam p les(n=3)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇 根據(jù)待測(cè)組分化學(xué)性質(zhì)上的特點(diǎn)［14］，曾采用70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、80%甲醇對(duì)合歡花進(jìn)行提取，結(jié)果90%乙醇提取所制備的供試品溶液干擾成分少，各主成分峰分離較理想;曾對(duì)超聲提取法和加熱回流法進(jìn)行考察，對(duì)于含有量較高的槲皮苷和異槲皮苷，超聲提取效果稍差，對(duì)于含有量較低的槲皮素，兩者沒有顯著差別，而超聲提取法簡(jiǎn)單省時(shí)、安全且易于平行獲取供試品溶液;也曾對(duì)超聲時(shí)間(40 min、60 min、90 min)，溶劑用量 (40 mL、50 mL、60 mL)進(jìn)行考察，區(qū)別不大。最終結(jié)果為用90%乙醇40 mL超聲40 min制備的合歡花藥材的供試品溶液較理想［8，11，15］。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取異槲皮苷、槲皮苷及槲皮素對(duì)照品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收掃描，結(jié)果異槲皮苷、槲皮苷及槲皮素均在360 nm有較大吸收，且實(shí)驗(yàn)對(duì)256 nm、350 nm、360 nm下樣品溶液的色譜峰進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，在360 nm下基線平穩(wěn)，各分析成分峰形較好。故選擇360 nm作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相磷酸水溶液的不同百分?jǐn)?shù) (0.1%磷酸溶液，0.2%磷酸溶液，0.4%磷酸溶液)，結(jié)果顯示0.2%磷酸溶液與0.4%磷酸溶液分離效果較好，且改善峰的拖尾現(xiàn)象，但二者差別不大，考慮到對(duì)色譜柱的保護(hù)則選擇甲醇-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)也考察了流動(dòng)相的不同比例 (44∶56，45∶55，40∶60，34∶66，32∶68)，不同溫度 (30℃，35℃)對(duì)出峰時(shí)間、雜質(zhì)成分的出現(xiàn)情況、峰型及分離度的影響，最后選定了甲醇-0.2%磷酸溶液 (34∶66)為流動(dòng)相;柱溫35℃作為分析條件。

3.4 成分含有量的差異 比較購(gòu)自8個(gè)產(chǎn)地的合歡花藥材中異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素的量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地購(gòu)買的合歡花藥材中此3類黃酮類的量差異較大。造成差異的原因可能是采摘的不同季節(jié)、不同生長(zhǎng)環(huán)境及儲(chǔ)藏方式不同等。

3.5 小結(jié) 《中國(guó)藥典》2010年版關(guān)于合歡花藥材只是對(duì)單一成分槲皮苷進(jìn)行了定量分析，本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定合歡花中異槲皮苷、槲皮苷及槲皮素3種黃酮類的量的高效液相色譜法，且方法靈敏度高，簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，為深入研究合歡花的物質(zhì)基礎(chǔ)提供一定方法依據(jù)。

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