風(fēng)味酸乳的制備及品質(zhì)檢測

涂毅 徐浩 沈逸

【摘 要】從市售酸奶中分離到了保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，制作了風(fēng)味酸乳。用雙縮脲法測定了蛋白質(zhì)的含量，用稀釋平板計(jì)數(shù)法測定了菌落總數(shù)。結(jié)果表明，接種保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌制作的酸奶口感好于單菌，隨著培養(yǎng)時間的遞增，乳酸菌菌落總數(shù)會先增后減，蛋白質(zhì)的含量會逐漸減少。

【關(guān)鍵詞】乳酸菌；酸奶發(fā)酵；蛋白質(zhì)含量；菌落總數(shù)

[Abstract] Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus were isolated from commercially available yogurt to made of yogurt. The protein content was determined by the biuret method， the total number of colonies was determined by dilution plate counting method. The results showed that， inoculation with Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus yogurt bacteria produced better product than single bacteria. As the culture time increased， lactic acid bacteria colony will first increased and then decreased， the content of protein gradually reduced.

[Key words] lactic acid bacteria；yogurt fermentation；protein content；total number of colonies

乳制品是用牛奶經(jīng)過不同的乳酸菌發(fā)酵等工藝加工而成的。由乳酸菌發(fā)酵制成的酸奶中，蛋白質(zhì)含量達(dá)2.8%以上，風(fēng)味獨(dú)特、酸甜可口、營養(yǎng)豐富，其中又含有活的益生菌，有利于人體腸道中有益菌群的平衡，是一種老幼皆宜的微生態(tài)制劑類保健飲品，具有很好的發(fā)展前景。乳酸菌是一類革蘭氏陽性球狀、球桿狀和桿狀細(xì)菌，最常用的酸奶發(fā)酵菌種是保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococus thermophilus）這兩類。酸奶發(fā)酵的原理是乳酸菌能夠在厭氧或兼性厭氧條件下發(fā)酵己糖產(chǎn)生乳酸，形成與人類生活密切相關(guān)的發(fā)酵產(chǎn)品[1]。

本研究將從市售酸奶產(chǎn)品中分離到保加利亞乳桿菌和嗜熱乳酸鏈球菌。用不同菌種發(fā)酵鮮奶，測定產(chǎn)品中蛋白質(zhì)和活菌含量，研究酸奶發(fā)酵的規(guī)律。

1.材料與方法

1.1 儀器與試劑

高壓蒸汽滅菌鍋（上海華線核醫(yī)），超凈工作臺（上海博訊），光學(xué)顯微鏡（南京舜宇），培養(yǎng)箱（上海新苗），可見光分光光度計(jì)（上海尤尼柯），離心機(jī)（德國sigma）。

原料奶粉：安嬰兒脫脂奶粉，產(chǎn)品編號Q/MZCH 0003S。

原料酸奶：蒙牛（只含保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）。

鹽酸，氫氧化鈉，氯化鈉，酒石酸鉀鈉，碘化鉀，硫酸銅，四氯化碳，蔗糖，溴甲酚綠，無水乙醇，碳酸鈣，檸檬酸氫二銨，葡萄糖，乙酸鈉，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，硫酸錳。以上試劑均為分析純。

牛血清白蛋白，酵母膏，瓊脂。以上為生化試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1乳酸菌的分離純化

按照文獻(xiàn)[2]的方法配制BCG牛乳培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和脫脂乳試管培養(yǎng)基。

將市售酸奶充分搖勻后，用無菌生理鹽水十倍稀釋法稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各種稀釋度的樣品液。

取0.2ml 10-2、10-3 兩個稀釋度的試管中原液，在BCG牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板上用涂布棒涂布分離，置40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。之后用MRS培養(yǎng)基進(jìn)一步分離。

選取經(jīng)初步鑒定的乳酸菌典型菌落，用接種環(huán)挑取轉(zhuǎn)至脫脂乳試管中，4℃培養(yǎng)8～24h。若牛乳出現(xiàn)凝固，無氣泡，呈酸性，涂片鏡檢細(xì)胞為桿狀或鏈球狀（兩種形狀的菌種分別選入），革蘭氏染色顯陽性，則可將其連續(xù)傳代4～6次，最終選擇出在3～6h能凝固的乳酸菌，作菌種待用。

1.2.2接種發(fā)酵

按奶粉、蔗糖、蒸餾水10：5：70的比例配制奶液，108℃滅菌15min后冷卻，在無菌操作臺中將保加利亞乳桿菌單菌和混合菌分別接種到含奶液的錐形瓶中，40℃培養(yǎng)發(fā)酵，24h后觀察是否產(chǎn)生凝乳，若有則進(jìn)行后續(xù)測定。

1.2.3品質(zhì)檢測

（1）蛋白質(zhì)含量測定

把牛血清白蛋白配制成不同濃度梯度的溶液，用雙縮脲法[3]測定其536nm處的吸光值，制作工作曲線。取自制酸奶產(chǎn)品1ml，同法測定，求出產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量。

（2）活菌計(jì)數(shù)

制備10倍系列樣品稀釋液，選擇3～4個適宜稀釋度的樣品溶液。

分別取0.2mL稀釋液均勻涂布于30塊計(jì)數(shù)培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h。記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，cfu）表示。

2.結(jié)果與討論

2.1乳酸菌的分離純化

將10-2、10-3 兩個稀釋度的酸奶稀釋液涂布在BCG培養(yǎng)基上，24h后觀察到菌落呈圓形，乳白色，直徑1～3mm，分布不均勻。用牙簽挑取乳白色菌落置于滅菌脫脂乳試管中培養(yǎng)24h，檢測發(fā)現(xiàn)呈濃稠狀態(tài)，涂片鏡檢為桿狀和球狀菌體，革蘭氏染色為陽性。在MRS固體培養(yǎng)基中生長的菌落形態(tài)為底部略帶微黃色，表面多為乳白色，邊緣不整齊，表面較光滑、濕潤，中間凸起。經(jīng)進(jìn)一步鏡檢分離，得到了純的保加利亞乳桿菌。

2.2接種發(fā)酵

采用分離到的保加利亞乳桿菌進(jìn)行單菌發(fā)酵，并用雙菌混合發(fā)酵作對比。產(chǎn)品形態(tài)及風(fēng)味如表1所示。

表1 發(fā)酵酸乳的形態(tài)與風(fēng)味

（△為酸度，越多則越酸；★為甜度，越多則越甜）

原奶液中沒有接種任何菌種，無任何味道變化；桿菌單菌發(fā)酵則較酸，無甜味；混合菌有奶香，有很淡的甜味，初步呈現(xiàn)市售酸奶的色、香、味。但是由于沒有加入任何添加劑，所以味道不如市售酸奶。

2.3品質(zhì)檢測

2.3.1蛋白質(zhì)含量測定

采用雙縮脲法測定536nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的工作曲線，如圖1所示。吸光度y與蛋白質(zhì)含量x（mg/ml）之間的關(guān)系式為y=0.04245x+0.0117，相關(guān)系數(shù)r=0.99895。

將保加利亞乳桿菌和混合雙菌分別進(jìn)行酸奶發(fā)酵，測定不同時間產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如表2所示。

從表2中可以看出，隨著發(fā)酵時間的遞增，脫脂奶液中蛋白質(zhì)的含量逐漸減少，因?yàn)槿樗峋纳L需要從蛋白質(zhì)和多肽中獲得氮源來維持它們的新陳代謝。自然環(huán)境中乳酸菌能夠很好地利用棲息地中的物質(zhì)生長，而乳中的乳酸菌能夠利用乳糖作為碳源，但不能同化無機(jī)氮源，因此，它們必須降解蛋白質(zhì)（如酪蛋白）和多肽來滿足細(xì)胞合成代謝對氨基酸的需要[7]。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)工作曲線

同時從表2中也可以看到，混合雙菌對蛋白質(zhì)的消耗利用大于桿菌單菌的。在市售酸奶中為了口感和香味達(dá)到比較好的水平，都采用雙菌或多種菌混合發(fā)酵，因而對蛋白質(zhì)的消耗更加明顯，所以必須放置于4℃低溫下保藏，以抑制乳酸菌的生長，使蛋白質(zhì)含量維持在一定水平，保持其營養(yǎng)價值。

表2 不同發(fā)酵時間下的蛋白質(zhì)含量

2.3.2活菌計(jì)數(shù)

在發(fā)酵72h后，對菌落數(shù)進(jìn)行了測定。其中混合菌菌落總數(shù)為1.165×109cfu/mL，桿菌菌落總數(shù)為9.25×108cfu/mL。酸奶的營養(yǎng)價值在很大程度上取決于其中的活乳酸菌含量。乳酸菌對其他有害菌的生長有較強(qiáng)的抑制作用。酸奶品質(zhì)好壞的一個重要指標(biāo)之一是活乳酸菌數(shù)多少。國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB16321—2003中規(guī)定，酸奶中活乳酸菌數(shù)必須達(dá)到106 cfu/mL以上[4]。

目前已知保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌之間存在共生關(guān)系。近年來有研究表明，并不是所有的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌之間都存在良好的共生關(guān)系，共生關(guān)系是否良好與每個菌株的生長動力學(xué)特異性有關(guān)[5]。所以對于混合雙菌中兩種菌的菌落數(shù)量比例并不是很清楚，雙菌和單菌菌落總數(shù)不好比較。

有文獻(xiàn)報(bào)道，酸奶中乳酸菌含量隨貯藏時間發(fā)生變化，在第7天前， 由于生長條件適宜，乳酸菌迅速生長和繁殖，從發(fā)酵前（1.05×107cfu/mL）到發(fā)酵后（4.20×109cfu/mL）僅2.5 h，含菌數(shù)提高了400倍，第5～7天達(dá)到高峰期，含菌量達(dá)（2.45～2.80）×1010cfu/mL。第8天后， 由于酸奶的糖分，蛋白質(zhì)等有機(jī)物含量有限，代謝產(chǎn)物增多，影響了乳酸菌的繁殖生長的理化環(huán)境，抑制了乳酸菌的生長，并導(dǎo)致部分死亡，含菌量逐漸下降[6]。因此保藏在4℃溫度下可以抑制其生長，使酸奶中乳酸菌總數(shù)維持在較高水平。

3.結(jié)論

本研究探討了乳酸菌發(fā)酵酸奶的制作方法，使用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵的方法制作了風(fēng)味酸乳。使用多菌種混合發(fā)酵對于成品酸奶的營養(yǎng)、口感等方面有很大的提升。

隨著發(fā)酵時間的遞增，酸奶中的蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)下降的趨勢，酸奶發(fā)酵的時間必須控制在較短范圍內(nèi)，同時保藏在較低溫度下。乳酸菌隨著酸奶中有機(jī)酸的增加，生長受到抑制，數(shù)量逐漸減少。

后續(xù)研究將優(yōu)化發(fā)酵條件，探索總?cè)楣腆w、菌種接入量、pH等因素對酸奶發(fā)酵的影響。

參考文獻(xiàn)：

[1] 薩麗塔娜提·居努斯.酸牛奶及乳酸菌飲料中乳酸菌的實(shí)驗(yàn)室測定[J].新疆畜牧業(yè)， 2004，12（25）：51-53.

[2] 朱寶玉，張秀麗，廖興等.乳酸菌計(jì)數(shù)條件的優(yōu)化研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2004，14（5）：42-43.

[3] 方改霞，單林娜，李慧等.多菌種酸奶中乳酸菌的計(jì)數(shù)方法研究[J].微生物學(xué)雜志，2009，05（24）：55-56.

[4] 白鳳翎，張柏林，趙宏飛.乳酸菌蛋白代謝研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2010，31（19）：381-384.

[5] 鄒雪，易霞.酸奶中乳酸菌的分離及其桿球比分析[J].食品科學(xué)，2008，3：118-122.

[6] 黃君紅，彭麗珍，王愛蘭.酸奶中乳酸菌含量的檢測[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2001，13（6）：324-325.

作者簡介：

涂毅（1982-），男。講師。主要從事微生物學(xué)方面的研究。