力達(dá)霉素在體內(nèi)外抑制小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0移植成瘤

甄永占，趙毓芳，駱廣玲，章廣玲，劉學(xué)軍，李 冉，闞 泉

(1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室;2.河北唐山開(kāi)灤醫(yī)療集團(tuán)林西醫(yī)院婦產(chǎn)科;3.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科，河北唐山063000)

多發(fā)性骨髓瘤是血液系統(tǒng)發(fā)病居第2位的常見(jiàn)惡性腫瘤，對(duì)化療存在普遍抵抗性，目前還是一種難以治愈的致死性疾病。標(biāo)準(zhǔn)的化療方案僅能使40%～60%患者獲得暫時(shí)緩解，中位生存期一般不超過(guò)3年。大劑量化療聯(lián)合造血干細(xì)胞移植可使緩解率明顯提高，除了極少數(shù)病例，最終難免復(fù)發(fā)［1］。正因?yàn)槿绱?，人們?duì)尋找新的抗多發(fā)性骨髓瘤藥寄予厚望，以進(jìn)一步提高多發(fā)性骨髓瘤患者的生存率和治愈率。力達(dá)霉素(lidamycin，LDM)是大分子肽類(lèi)抗腫瘤抗生素，大量研究表明，LDM具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性［2－4］，目前正在國(guó)內(nèi)進(jìn)行臨床Ⅱ期試驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)研究了力達(dá)霉素體內(nèi)、體外抗鼠骨髓瘤作用，為今后力達(dá)霉素在多發(fā)性骨髓治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由本室傳代保存。用含10%胎牛血清(Hyclone)的高糖DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，2 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。力達(dá)霉素由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所甄永蘇院士惠贈(zèng)。蛋白定量試劑盒(BCATMprotein assay kit)(Pierce產(chǎn)品);寬范圍蛋白預(yù)染Marker(New England Biolabs公司);蛋白質(zhì)印跡發(fā)光液和PVDF膜(Millipore公司);碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞周期檢測(cè)檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司);NF-κB抗體(sc-8008)、BCL-2抗體(sc-492)、Survivin抗體(sc-8807)、P27抗體(sc-1641)和Actin抗體(sc-1616)(Santa Cruz公司);HRP標(biāo)記的羊抗兔、兔抗羊和羊抗小鼠IgG抗體(北京中杉金橋有限責(zé)任公司)。BALB/c小鼠，SPF級(jí)，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，合格證號(hào):SCXK(京)2007-0001。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖活性檢測(cè):MTS法測(cè)定細(xì)胞存活率，MTS［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt］是MTT的一種新型類(lèi)似物，化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2-磺)-5-(3-羧甲基氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2氫四唑內(nèi)鹽，簡(jiǎn)稱(chēng)MTS。原理是MTS在PMS(phenazine methosulfate)存在的情況下可被活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶類(lèi)還原，轉(zhuǎn)化成液態(tài)可溶的產(chǎn)物，而死細(xì)胞無(wú)此功能，該水溶物可用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)，測(cè)定在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，該值可間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量和活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，輕輕吹打分散成細(xì)胞懸液，記數(shù)后以細(xì)胞數(shù)1×104/孔接種細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2 h后加入不同濃度的藥物處理48 h，每組至少3個(gè)平行孔。每孔加入20 μL MTS和PMS混合液(按說(shuō)明書(shū)配制:每2 mL MTS溶液中加入100 μL PMS，現(xiàn)用現(xiàn)配)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，用酶標(biāo)儀(Thermo Labsystems，Multiskan MK3)于490 nm處測(cè)定每個(gè)孔的吸光度(A490)值。實(shí)驗(yàn)設(shè)無(wú)藥對(duì)照孔和無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔各3孔，按下面公式計(jì)算細(xì)胞的存活率:細(xì)胞存活率=(加藥組A490值－空白組A490值)/(對(duì)照組A490值－空白組A490值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡:細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，收集細(xì)胞，加入冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液將細(xì)胞輕輕吹打成單個(gè)細(xì)胞，離心，PBS洗2遍，用約500 μL的PBS重懸細(xì)胞，一邊振蕩一邊加入5 mL預(yù)冷的70% 乙醇，4℃固定過(guò)夜(如不及時(shí)測(cè)定，可放－20℃保存兩周)。染色前細(xì)胞用PBS洗2遍，沉淀重懸于PI染液中(50 mg/L PI+200 mg/L RNase A)，37℃避光染色30 min。細(xì)胞經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA含量并分析細(xì)胞周期變化和細(xì)胞凋亡。

1.2.3 Western blot分析:收集 0.1、0.5、1 和2 nmol/L的LDM作用48 h及未加藥處理的SP2/0細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗3遍，加入新鮮配制的細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5;1%NP-40;150 mmol/LNaCl;1 mmol/L Na3VO4;1 mmol/L NaF，臨用時(shí)加入3種蛋白酶抑制劑1%抑蛋白酶肽;10 g/L亮抑酶肽;1 mmol/L苯甲基磺酰氟)100 μL，細(xì)胞與裂解液充分混合，冰浴20 min。于4℃，13 000 r/min離心15 min，收集上清液于新的微量離心管中，按照BCA法測(cè)定蛋白含量。取各樣品等量總蛋白30 μg加入0.25倍體積的5×上樣緩沖液，煮沸變性5 min后，在10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)膠上進(jìn)行電泳。然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，1%牛血清白蛋白封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜后，加相應(yīng)二抗孵育2 h，膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑(Santa Cruz biotechnology SC-2048)，按照試劑說(shuō)明進(jìn)行操作，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)拍照保存結(jié)果。

1.2.4 鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0移植成瘤的實(shí)驗(yàn)治療:小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞用0.9%氯化鈉注射液制成細(xì)胞懸液，給每只小鼠右側(cè)腋窩皮下接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量為(1×106)。在細(xì)胞接種后1和8 d尾靜脈注射給藥2次，LDM按照0.1、0.05和0.025 mg/kg劑量。對(duì)照組給予同體積的0.9%氯化鈉注射液。每隔2～3 d測(cè)量瘤塊的長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤的體積，并記錄動(dòng)物體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)第14天處死動(dòng)物，剝離各組動(dòng)物的瘤塊，直觀(guān)地比較腫瘤大小，并稱(chēng)重計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(對(duì)照組瘤重－實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

LDM呈濃度依賴(lài)性抑制SP2/0細(xì)胞增殖，48 h時(shí) IC50為0.56 nmol/L(圖1)。

圖1 LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Growth inhibition of SP2/0 cells by LDM(±s，n=3)

2.2 LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡的影響

0.1、0.5、1和2 nmol/L的LDM 作用SP2/0細(xì)胞48 h均能誘導(dǎo)G2/M期阻滯，0.5 nmol/L的LDM誘導(dǎo)的G2/M期阻滯最明顯，隨著劑量的增大(1和2 nmol/L)，凋亡相關(guān)的亞G1峰比例顯著增加，因此誘導(dǎo)的G2/M期阻滯作用反不如0.5 nmol/L的LDM明顯(圖2)。

圖2 LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 Cell cycle distribution and apoptosis of SP2/0 cells after treatment with LDM

隨著LDM濃度的升高，Sub-G1期細(xì)胞的數(shù)量也增加。1和2 nmol/L LDM可分別引起16.03%和39.87%的SP2/0細(xì)胞產(chǎn)生Sub-G1峰(圖3)。

2.3 LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)蛋白的影響

LDM作用SP2/0細(xì)胞48 h后，LDM濃度依賴(lài)性增加SP2/0細(xì)胞poly ADP-ribose polymerase(PARP)的切割片斷蛋白表達(dá)，濃度依賴(lài)性地降低SP2/0細(xì)胞NF-κB、BCL-2和Survivin的表達(dá)，濃度依賴(lài)性地上調(diào)BAX和P27蛋白的表達(dá)(圖4)。

2.4 小鼠骨髓瘤細(xì)胞移植成瘤模型觀(guān)察力達(dá)霉素在體內(nèi)的抑瘤作用

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞凋亡的影響Fig 3 Induction of cell apoptosis by LDM in SP2/0 cells

LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞移植瘤顯著抑制生長(zhǎng)，呈劑量依賴(lài)性，實(shí)驗(yàn)第14天處死動(dòng)物，剝離各組動(dòng)物的瘤塊拍照，直觀(guān)地比較腫瘤大小，可以看到LDM組的腫瘤明顯小于對(duì)照組，而且0.1 mg/kg劑量LDM組中有兩只沒(méi)有形成瘤塊。稱(chēng)重計(jì)算抑瘤率(圖5，表1)，0.1、0.05和0.025 mg/kg劑量LDM 組的抑瘤率分別為97.3%、86.3%和35.7%。接種后第10天LDM 0.1 mg/kg劑量組，有一只死亡，表明動(dòng)物對(duì)LDM的耐受劑量為0.05 mg/kg以下。

在實(shí)驗(yàn)期間，各組動(dòng)物的體質(zhì)量無(wú)明顯變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，LDM治療組的動(dòng)物體質(zhì)量與對(duì)照組相比，沒(méi)有顯著性差異(表1)。

3 討論

盡管對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的生物學(xué)研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，并采用了大劑量化療的治療方案，對(duì)于絕大多數(shù)患者來(lái)說(shuō)仍然是一種難以治愈的致死性疾病。鑒于此，人們對(duì)尋找新的抗癌藥寄予厚望，以進(jìn)一步提高多發(fā)性骨髓瘤患者的生存率和治愈率。

表1 LDM對(duì)小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用Table 1 Inhibitory effects of LDM on the growth of mouse myeloma SP2/0 in BALB/c mice

圖4 LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 4 The expression of proteins associated with apoptosis and cell cycle in SP2/0 cells by Western blot analysis(n=3)

圖5 LDM對(duì)小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用Fig 5 The picture was taken on day 14 after cell implantation

LDM是由一個(gè)含110個(gè)氨基酸的酸性輔基蛋白和一個(gè)含烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合而成的化合物，其中發(fā)色團(tuán)是LDM的主要活性部分，具有斷裂DNA的作用，而輔基蛋白的主要作用是保護(hù)發(fā)色團(tuán)。大量研究表明，力達(dá)霉素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性［2－4］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LDM濃度依賴(lài)性抑制SP2/0細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。凋亡誘導(dǎo)作用與LDM濃度依賴(lài)性降低SP2/0細(xì)胞NF-κB、BCL-2和survivin的表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白有關(guān)，LDM可使SP2/0細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，這與濃度依賴(lài)性上調(diào)P27蛋白的表達(dá)有關(guān)。Caspase是細(xì)胞凋亡的核心所在。各種引起凋亡的因素，無(wú)論是Fas死亡因子、腫瘤壞死因子、CTL細(xì)胞分泌的 granzyme B、ceramide及P53等均先激活caspase才能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，PARP是caspase家族的切割底物，是細(xì)胞凋亡的一個(gè)早期分子標(biāo)志。

NF-κB是一個(gè)與腫瘤生成有關(guān)的生存因子，它的活化會(huì)使腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡產(chǎn)生抗性［5］。BCL-2是一種抗凋亡蛋白，它可以通過(guò)與Bax形成異源二聚體而起到抗凋亡作用，研究認(rèn)為，BAX與BCL-2的表達(dá)比例決定細(xì)胞的生存與凋亡［6－7］。Survivin是凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成員，可通過(guò)抑制caspase-3、caspase-7阻斷細(xì)胞凋亡。研究表明，survivin除抑制細(xì)胞凋亡外，還與細(xì)胞周期、血管形成、腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、耐藥和放療抗拒等有關(guān)［8］。P27是一種細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子。

為了進(jìn)一步研究LDM抗骨髓瘤的作用，采用小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞移植成瘤模型，結(jié)果顯示，LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴(lài)性，與對(duì)照組相比有顯著性差異。因接種后第10天0.1 mg/kg LDM劑量組有一只死亡，表明動(dòng)物不能耐受該劑量。在實(shí)驗(yàn)期間，雖然0.1 mg/kg LDM劑量組體重下降，但與對(duì)照組相比，沒(méi)有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)小鼠無(wú)其他毒性反應(yīng)。

綜上所述，LDM能夠通過(guò)降低 SP2/0細(xì)胞NF-κB、BCL-2和 Survivin的表達(dá)，上調(diào) BAX表達(dá)，抑制鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。通過(guò)上調(diào)P27蛋白的表達(dá)，使SP2/0細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，而且LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)為L(zhǎng)DM抗人多發(fā)性骨髓瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)研究提供了理論依據(jù)。

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