PLGF通過激活Rho/ROCK信號通路介導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接開放

王 淳，李 波，方文剛，陳譽(yù)華*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生生物教研室，遼寧沈陽110032;2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院發(fā)育生物教研室衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實驗室，遼寧沈陽110001)

血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接(tight junction，TJ)及其外的基膜等組成的一種致密性結(jié)構(gòu)，具有阻止有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織，維持腦組織正常生理功能的作用［1］。目前認(rèn)為，一些大分子、微生物、細(xì)胞通過破壞TJ的完整性進(jìn)入腦實質(zhì)［2］。

胎盤生長因子(placental growth factor，PLGF)是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族中的一員，除在胎盤絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞層中高表達(dá)外，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、子宮自然殺傷細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等中也高表達(dá)［3-4］。PLGF與受體VEGFR-1(Flt-1)結(jié)合具有促進(jìn)血管生成的作用［5-6］。有文獻(xiàn)表明，PLGF可以使大鼠BBB通透性增加［7］，但其調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。

本實驗利用體外培養(yǎng)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells，HBMEC)，研究PLGF是否能夠改變BBB的完整性，并初步探討其誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

HBMEC(美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Kwang Sik Kim博士惠贈);1640培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)和新生牛血清(BD公司);人重組蛋白PLGF-1(Cell Sciences公司);Transwell(Corning 公 司);Y27632、LY294002、wortimannin、G?6976、G?6983、SB203580 和 PD98059(Calbiochem 公司);辣根過氧化物酶(horse-radish peroxidase，HRP)、小鼠抗ZO-1單克隆抗體和兔抗occludin多克隆抗體(Zymed公司);兔抗Rho多克隆抗體和GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz公司);FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(北京中山生物公司);Rho activation assay kit(Upstate公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):HBMEC培養(yǎng)于含10%胎牛血清，10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2，100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 體外血腦屏障模型的建立［1，8-9］:將3 μm Transwell小室置于24孔培養(yǎng)板中，將1×105個HBMEC接種于Transwell上室，接種后每天用EVOM voltohmmeter(細(xì)胞電位儀——用于測量生物組織培養(yǎng)研究中跨膜上皮細(xì)胞電阻抗，WPI公司)測量跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻抗(transendothelial electrical resistance，TEER)，當(dāng)TEER≥200 ohm·cm2時，表明體外血腦屏障模型建立成功。

1.2.3 跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻抗的測定及體外血腦屏障模型通透性的檢測:構(gòu)建成功的體外血腦屏障模型于0.5%胎牛血清，0.5%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，在Transwell上室加入人重組蛋白PLGF，分別檢測不同濃度、不同作用時間條件下TEER值。

在有或無蛋白激酶抑制劑(Y27632、LY294002、wortimannin、G?6976 和 G?6983)預(yù)處理1 h后加入PLGF，再于Transwell上室加入辣根過氧化物酶(HRP)，使 HRP 終濃度為0.5 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，收集Transwell下室液體，A492nm測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算HRP的通透率(ng/cm2)。

1.2.4 Western blot方法檢測緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá):25 ng/mL PLGF處理HBMEC 1 h。收獲細(xì)胞，以 Triton X-100 蛋白質(zhì)裂解液(25 μmol/L HEPES/NaOH，150 μmol/L EDTA，1%Triton X-100，蛋白酶抑制劑)溶解，離心后，收獲上清用以檢測可溶性蛋白組分;沉淀再溶于SDS蛋白質(zhì)裂解液(1%SDS，25 μmol/L HEPES/NaOH，4 μmol/L EDTA，1%Triton X-100，蛋白酶抑制劑)，用以檢測細(xì)胞不可溶性組分。蛋白質(zhì)組分分別經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，檢測可溶性occludin(S-occludin)和不可溶性occludin(IS-occludin)表達(dá)水平。經(jīng)VDS圖像分析系統(tǒng)對印記圖像量化處理后，分別比較S-occludin/GAPDH和IS-occludin/GAPDH的吸光度強(qiáng)度參數(shù)比值，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(平行3次實驗，n=3)。

1.2.5 免疫熒光法觀察緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白ZO-1的分布:HBMEC細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于無菌蓋玻片上，待細(xì)胞達(dá)到完全融合后，加入25 ng/mL人重組蛋白PLGF。一定時間，取出蓋玻片，固定、封閉，1∶100稀釋的小鼠ZO-1單克隆抗體4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG室溫孵育1 h后，封片、熒光顯微鏡下觀察，數(shù)碼相機(jī)采集圖像。

1.2.6 Rho活性檢測:參照Rho活性檢測試劑盒說明書，細(xì)胞裂解液首先與瓊脂糖珠子孵育45 min，離心得到的瓊脂糖珠子-蛋白樣品用常規(guī)Western blot方法檢測，印記圖像量化處理后，比較Rho-GTP/total Rho吸光度強(qiáng)度參數(shù)比值，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(n=3)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料的數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，其結(jié)果的比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PLGF對體外血腦屏障模型通透性的影響

隨著PLGF濃度增加，TEER逐漸降低，當(dāng)加入25 ng/mL PLGF時，TEER降至最低點(diǎn)(與0 ng/mL PLGF相比，P＜0.05)，以后進(jìn)入平臺期(圖1A)。觀察PLGF作用不同時間后TEER的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn):25 ng/mL的 PLGF可降低 TEER值，干預(yù)30 min后TEER降至最低點(diǎn)(與干預(yù)0 min相比，P＜0.05);此后，隨著時間的延長，TEER逐漸升高(圖1B)。

PLGF可引起HRP通透率增加，并與降低TEER結(jié)果相一致，存在劑量和時間依賴性(圖1C，D)。

2.2 PLGF對HBMEC間緊密連接結(jié)構(gòu)的影響

圖1 PLGF誘導(dǎo)體外血腦屏障模型通透性增加Fig 1 PLGF induced BBB permeability increase in vitro

25 ng/mL PLGF使HBMEC細(xì)胞中S-occludin表達(dá)增加，干預(yù)后30 min達(dá)到高峰(與干預(yù)0 min相比，P＜0.05)，以后隨著時間延長，可溶性occludin逐漸減少;與此相對，PLGF降低了IS-occludin的含量(圖2)。此外，PLGF亦可引起緊密連接完整性發(fā)生改變，作用30 min時，TJ改變最為明顯，以后逐漸得到恢復(fù)(圖3)。

2.3 PLGF通過激活Rho/ROCK信號通路介導(dǎo)HBMEC間緊密連接的改變

Y27632(ROCK蛋白激酶抑制劑)可有效抑制PLGF引起的體外血腦屏障模型通透增加現(xiàn)象，而LY294002和wortimannin(PI3K蛋白激酶抑制劑)、G?6976和G?6983(PKC蛋白激酶抑制劑)均不能抑制PLGF引起的體外血腦屏障模型通透增加的現(xiàn)象(圖4)。此外，PLGF處理HBMEC 30 min后，可檢測到Rho蛋白的活化，即Rho-GTP;并隨著PLGF濃度的增加Rho-GTP逐漸增加(圖5)。

圖2 PLGF對緊密連接跨膜蛋白o(hù)ccludin的影響Fig 2 The effect of PLGF on the tight junction's transmembrane protein occludin in HBMEC

3 討論

將HBMEC種植在Transwell上室構(gòu)建體外血腦屏障模型，是目前研究血腦屏障通透性的常用方法［1，8-9］。將PLGF加入到體外血腦屏障模型上室，發(fā)現(xiàn)PLGF能引起跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻抗的變化，使大分子化學(xué)標(biāo)志物HRP透過率增加，說明PLGF能改變BBB的通透性，這與PLGF增加大鼠BBB通透性的結(jié)果相一致［7］。但隨著PLGF作用時間的延長及劑量的加大，血腦屏障有逐漸恢復(fù)的趨勢，這可能是HBMEC啟動自身修復(fù)機(jī)制的原因。

圖3 PLGF對緊密連接胞質(zhì)附著蛋白ZO-1的影響Fig 3 PLGF effectes the tight junction's cytoplasmic attachment protein of HBMEC(×400)

在BBB的構(gòu)成中，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間形成的緊密連接是保持血腦屏障完整性的重要因素。緊密連接主要由跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白和部分細(xì)胞骨架組成，具有支持及維持緊密連接穩(wěn)定性的作用［9］，因此，通過檢測跨膜蛋白和胞質(zhì)附著蛋白在緊密連接中的分布情況，可間接體現(xiàn)構(gòu)成血腦屏障的緊密連接的完整性。本研究利用Western blot和免疫熒光技術(shù)對構(gòu)成緊密連接的跨膜蛋白(occludin)和胞質(zhì)附著蛋白(ZO-1)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PLGF可引起緊密連接相關(guān)膜蛋白的重新分布，證實PLGF的確能影響血腦屏障的完整性。那么，PLGF通過何種途徑破壞了血腦屏障的完整性?

Rho GTPases是細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移的重要影響因子，在人類已發(fā)現(xiàn)20多種 Rho家族成員，如RhoA、Rac和Cdc42等。Rho蛋白與GTP結(jié)合時呈現(xiàn)激活狀態(tài)，與 GDP結(jié)合時表現(xiàn)為失活狀態(tài)［10］。Rho蛋白活化后作用于下游靶分子，如Rho激酶(Rho associated kinase，ROCK)，使其磷酸化而激活;后者活化后進(jìn)一步作用于下游一系列靶分子最終引起細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)——微絲的聚合，從而使細(xì)胞收縮，細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)受到破壞［11-12］。前期已證實，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞穿過體外血腦屏障模型過程中激活了Rho/ROCK通路［8］，那么，PLGF是否也通過激活Rho/ROCK通路引起血腦屏障完整性的改變?首先，分別應(yīng)用ROCK、PI3K和PKC通路抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有ROCK激酶抑制劑能抑制PLGF引起體外血腦屏障模型對HRP的通透;此外，PLGF作用HBMEC后，還可檢測到Rho蛋白的活化狀態(tài) (即Rho-GTP)逐漸增多。結(jié)果提示，PLGF可能通過激活Rho/ROCK通路破壞HBMEC間緊密連接的完整性。

通過以上結(jié)果，PLGF通過激活Rho/ROCK信號通路，破壞腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)緊密連接開放。

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