人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨與成脂分化過程中FGF1及其受體表達(dá)的變化

董 平，焦 虎，李秋晨，呂曉巖，尹艷花，肖 苒

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心，北京100144)

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)因具有自我更新和多向分化能力而被廣泛應(yīng)用于組織工程與再生醫(yī)學(xué)，對hBMSCs多向分化能力的調(diào)控是其臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)及其受體(fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)是調(diào)控成骨與成脂發(fā)生的重要分子［1-2］，然而它們在hBMSCs成骨與成脂分化過程中的動態(tài)表達(dá)及其作用機(jī)制并不清楚。本實驗就hBMSCs在成骨與成脂分化過程中FGF1及其受體mRNA的動態(tài)表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)研究，并進(jìn)一步探討外源性FGF1對于hBMSCs成骨與成脂分化的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM和青霉素-鏈霉素(HyClone公司);PBS(Sigma公司);胎牛血清和0.25%胰蛋白酶(Gibco公司);M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司);dNTP和oligodT(Promige公司);引物合成(北京賽百盛);SYBER Green Master Mix(Roche公司);小鼠抗人FGF1抗體(sc-101145)、(Santa Cruz公司);Alexa Fluor? 594驢抗小鼠IgG(A21203)(Invitrogen公司);重組人FGF1(北京義翹神州)。

1.2 hBMSCs的分離純化和擴(kuò)增

取健康志愿者(年輕男性，知情同意)髂骨骨髓血，密度梯度離心，取中間云霧層細(xì)胞接種培養(yǎng)并記為P0代細(xì)胞。接種后7～10 d，用胰蛋白酶消化傳代純化并擴(kuò)增。

1.3 hBMSCs的定向誘導(dǎo)和鑒定

將P3代hBMSCs接種至6孔板，待細(xì)胞90%～95%匯合更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，此時記為第0天。成骨誘導(dǎo)(Os:低糖完全培養(yǎng)基+0.01 μmol/L地塞米松 +10 mmol/L β-甘油磷酸鈉 +50 μmol/L抗壞血酸)21 d后細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色、成脂誘導(dǎo)(AM:低糖完全培養(yǎng)基+0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌+1 μmol/L地塞米松 +200 μmol/L吲哚美辛 +10 μmol/L胰島素)10 d細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色并在不同時間點(diǎn)real-time PCR檢測相關(guān)標(biāo)志基因。分別加入終濃度為 10和25 μg/L外源性 FGF1和20 000 U/L肝素的成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)7 d后油紅O染色并real-time PCR檢測成脂標(biāo)志基因表達(dá)。含相同濃度FGF1和肝素的成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3 d后檢測成骨標(biāo)志基因表達(dá)。

hBMSCs成骨分化鑒定:37℃用0.1%茜素紅-Tris-HCl染液染色30 min，蒸餾水沖洗后鏡下觀察。

hBMSCs成脂分化鑒定:室溫用油紅O染液染色30 min，蒸餾水沖洗5 min，鏡下觀察。

1.4 Real-time PCR

根據(jù)Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總 RNA，取500 ng總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后real-time PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)水平。引物序列為:FGF1上游5'-TACAAGAAGCCCAAACTCCTC-3'，下游 5'-ATTTGGT GTCTGTGAGCCGT-3';FGFR1上游5'-ACCACCGACA AAGAGATGGA-3'，下游 5'-GCAGAGTGATGGGAGA GTCC-3';FGFR2IIIb上游5'-TCTGCCTGGCTCACTGTC-3'，下 游 5'-CTTGGTCGTGTTCTTCATTCG-3';FGFR2IIIc上游5'-GCTTGGCGGGTAATTCTATTG-3'，下 游 5'-CTTGGTCGTGTTCTTCATTCG-3';FGFR3IIIb上游 5'-AGGATGAACAGGAAGAAGCC-3'，下 游 5'-TCTG TCGAGCCACCAATTTC-3';FGFR3IIIc上游5'-CACC CTACGTTACCGTGCTCAA-3'，下游 5'-AGCCACGCA GAGTGATGAGAA-3';FGFR4上游5'-TGACTCCTTAC CTCCAGCA-3'，下 游 5'-ATGCCTCCAATGCGGTTCTC-3';RUNX2上游 5'-ACTGGCGCTGCAACAAGAC-3'，下 游 5'-CCCGCCATGACAGTAACCA-3';PPARγ上游5'-TGGAATTAGATGACAGCGACTTGG-3'，下 游 5'-CTGG AGCAGCTTGGCAAACA-3';GAPDH上游 5'-GCACC GTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游5'-TGGTGAAGACGCC AGTGGA-3'。

1.5 免疫熒光染色

分別取hBMSCs誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)3 d的細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%Triton X-100透化5 min，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1.5 h，DAPI染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hBMSCs成骨、成脂誘導(dǎo)分化及鑒定

hBMSCs成骨誘導(dǎo)21 d發(fā)現(xiàn)明顯的礦物質(zhì)沉積，茜素紅染色可見紅色的礦化結(jié)節(jié)，成骨標(biāo)志基因RUNX2表達(dá)升高(P＜0.01)，第7天到達(dá)峰值(圖1A，B，C);hBMSCs成脂誘導(dǎo)10 d鏡下細(xì)胞中可見明顯脂滴，經(jīng)油紅O染色脂滴呈紅色，成脂標(biāo)志基因PPARγ表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01)(圖1D，E，F(xiàn))。

2.2 hBMSCs成骨、成脂分化過程中FGF1的動態(tài)表達(dá)

FGF1 mRNA在hBMSCs成骨誘導(dǎo)后1～3 d表達(dá)升高(P＜0.05)，之后逐漸恢復(fù)到誘導(dǎo)前水平;而FGF1在hBMSCs成脂誘導(dǎo)后1～5 d表達(dá)顯著下降(P＜0.01)(圖2A)。免疫熒光染色顯示FGF1在hBMSCs中的表達(dá)有明顯核質(zhì)差異，主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，成骨誘導(dǎo)3 d后核質(zhì)差異減小，成脂誘導(dǎo)中FGF1蛋白表達(dá)明顯減少(圖2B，C，D)。

2.3 hBMSCs成骨、成脂分化過程中FGFRs的動態(tài)表達(dá)

FGFR1、FGFR2IIIb、FGFR2IIIc和 FGFR4 mRNA在hBMSCs成骨、成脂分化中呈現(xiàn)相同的表達(dá)趨勢，并且在表達(dá)最高點(diǎn)與誘導(dǎo)前相比顯著增強(qiáng)(P＜0.01)(圖3A，B，C，F(xiàn))。FGFR1 在成骨誘導(dǎo)中達(dá)到峰值的時間較成脂誘導(dǎo)晚(圖3A);FGFR2IIIc和FGFR4在成脂誘導(dǎo)過程中表達(dá)始終高于誘導(dǎo)前(P＜0.05)，但在成骨誘導(dǎo)14 d表達(dá)顯著低于誘導(dǎo)前(P ＜0.01)(圖 3B，C，F(xiàn));FGFR3IIIb和 FGFR3IIIc從誘導(dǎo)1 d起表達(dá)較誘導(dǎo)前顯著降低(P＜0.01)，并且成脂誘導(dǎo)時下降較成骨誘導(dǎo)迅速(圖3D，E)。

圖1 hBMSCs成骨與成脂誘導(dǎo)分化及鑒定Fig 1 The osteogenic and adipogenic differentiation of hBMSCs

2.4 外源性FGF1對hBMSCs成脂分化的影響

在成脂分化誘導(dǎo)液中加入外源性的FGF1及肝素誘導(dǎo)hBMSCs 7 d后油紅O染色發(fā)現(xiàn)4組都有脂滴出現(xiàn)，而加入FGF1的兩組脂滴明顯少于不加或只加肝素的兩組，不同濃度FGF1兩組之間并無明顯差異(圖4A，B，C，D)。相對于對照組，加入FGF1組能夠顯著抑制 PPARγ、C/EBPα的表達(dá)(P＜0.01)，肝素也有一定的抑制作用(圖4E，F(xiàn))。

2.5 外源性FGF1對hBMSCs成骨分化的影響

在成骨誘導(dǎo)液中加入同樣濃度的FGF1以及肝素，誘導(dǎo)hBMSCs 3 d發(fā)現(xiàn)加入FGF1的兩組成骨標(biāo)志基因OPN表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，但FGF1并沒有影響RUNX2的表達(dá) (圖5A，B)。

3 討論

FGFs是一類多肽類活性物質(zhì)，能夠調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。大多數(shù)FGFs含有信號序列并以自分泌/旁分泌的作用結(jié)合并激活相應(yīng)受體，發(fā)揮其生物功能。如在BMSCs誘導(dǎo)過程中發(fā)現(xiàn)自分泌的FGF18可以通過FGFR1與FGFR2介導(dǎo)地塞米松誘導(dǎo)的成骨分化，而FGF10能夠通過旁分泌的方式激活FGFR2 IIIb從而促進(jìn)成脂分化［2-3］。

本實驗檢測了FGF1在hBMSCs成骨與成脂分化過程中的動態(tài)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FGF1在兩系分化早期呈現(xiàn)相反的變化，推測FGF1可能通過自分泌方式促進(jìn)hBMSCs成骨分化而抑制其成脂分化。FGF1主要在hBMSCs細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，成骨誘導(dǎo)3 d后核質(zhì)中蛋白表達(dá)量差異減小，可能在成骨分化過程中FGF1蛋白發(fā)生了核轉(zhuǎn)位。本實驗發(fā)現(xiàn)FGFR1和FGFR2IIIc的表達(dá)趨勢與FGF1同步或滯后，從表達(dá)量以及表達(dá)時間兩方面綜合分析，F(xiàn)GF1對hBMSCs成骨分化的作用可能主要由FGFR1和FGFR2IIIc來介導(dǎo)。

目前對于FGF1在干細(xì)胞成脂分化中的作用并不明確，根據(jù)對脂肪前體細(xì)胞的研究，F(xiàn)GF1能夠通過抑制FGF2的表達(dá)促進(jìn)其向脂肪細(xì)胞方向分化［4-5］，然而低濃度(6 ng/mL)的FGF1能夠顯著抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化，而且高脂飲食喂養(yǎng)敲除Fgf1的小鼠中也出現(xiàn)脂肪異常增生［6-7］。本實驗中也發(fā)現(xiàn)FGF1能夠抑制hBMSCs成脂分化，且與肝素有協(xié)同抑制作用。

有研究稱FGF1能夠促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分泌骨鈣素與骨橋蛋白，服用FGF1的正常動物在骨干處膜內(nèi)成骨現(xiàn)象明顯，并且在骨缺損部位，除了募集有成骨前體基質(zhì)細(xì)胞外，還發(fā)現(xiàn)大量的FGF1，因此FGF1可能促進(jìn)這些前體細(xì)胞成骨分化，但這種促進(jìn)作用可能只發(fā)生在分化前期［8-9］。本研究中FGF1在成骨分化早期(3 d)表達(dá)升高，并且加入外源性FGF1成骨誘導(dǎo)3 d也發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白表達(dá)增加，說明FGF1可能對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞早期成骨分化有一定的促進(jìn)作用。

骨髓中成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞數(shù)量維持在一個平衡狀態(tài)，并且二者均來源于一個前體細(xì)胞即BMSCs，有人認(rèn)為PPARγ或Wnt可能參與調(diào)節(jié)這種平衡［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)FGF1在抑制成脂發(fā)生的同時促進(jìn)成骨標(biāo)志基因的表達(dá)，因而FGF1是否參與維持骨髓中成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞的平衡還有待進(jìn)一步研究。

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