妊娠相關(guān)蛋白在多囊卵巢綜合征早期自然流產(chǎn)患者的表達(dá)及臨床意義

郝 明，周 楠，胡興茂，王慶琴

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是最常見的婦科內(nèi)分泌疾病之一，臨床主要表現(xiàn)為高雄激素血癥、持續(xù)不排卵和胰島素抵抗［1］，也是引起無排卵性不孕的最常見原因。PCOS患者不僅表現(xiàn)為不孕，且早期自然流產(chǎn)率也較高，表現(xiàn)為妊娠3個(gè)月內(nèi)流產(chǎn)［2］。有研究顯示，PCOS患者早期自然流產(chǎn)率是正常女性的3倍［3］。目前其原因尚不清楚，但是隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜功能的改變可能發(fā)揮了重要的作用，從而影響正常胚胎的發(fā)育而導(dǎo)致流產(chǎn)［4］。胰島素抵抗與高胰島素血癥引起PCOS患者流產(chǎn)的機(jī)制尚不明確，但我們推測可能與胰島素抵抗與高胰島素血癥導(dǎo)致子宮內(nèi)膜分泌人妊娠相關(guān)蛋白(glycodelin)減少，循環(huán)血中g(shù)lycodelin濃度降低，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜環(huán)境的改變有關(guān)。因此本研究對(duì)妊娠3個(gè)月內(nèi)的PCOS患者以及正常女性進(jìn)行了橫斷面研究，以期為PCOS的臨床研究和流產(chǎn)的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年4月—2013年4月在我院婦科門診就診并確診為妊娠3個(gè)月內(nèi)(孕周＜12周)流產(chǎn)的PCOS 77例為試驗(yàn)組，均符合鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)［5］，即以下3項(xiàng)中至少存在2項(xiàng):①稀發(fā)排卵或無排卵;②高雄激素血癥或高雄激素的臨床表現(xiàn)(如多毛、痤瘡等);③在月經(jīng)周期或黃體酮撤退后出血3～5 d行超聲檢查，顯示雙側(cè)卵巢均有≥12個(gè)且直徑為2～9 mm的小卵泡和(或)卵巢體積增大＞10 ml。此外，診斷時(shí)還需除外引起高雄激素血癥的其他原因，如高泌乳素血癥和甲狀腺疾病、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、庫欣綜合征、雄激素分泌性腫瘤、21-羥化酶缺乏性非典型腎上腺皮質(zhì)增生、外源性雄激素應(yīng)用等。所有患者均為自然受孕，排除輔助受孕者;孕6～12周，彩超提示胚胎停止發(fā)育，均排除孕期感染及有害物質(zhì)接觸史;夫婦雙方染色體正常，無嚴(yán)重全身性疾病;男方精液檢查正常。隨機(jī)選擇同期正常孕期(孕＜12周)要求流產(chǎn)的婦女68例作為對(duì)照組。所有觀察對(duì)象排除內(nèi)分泌疾病，3個(gè)月內(nèi)無激素用藥史。根據(jù)胎齡將試驗(yàn)組和對(duì)照組分別分為孕3～5周，孕6～8周，孕9～11周。兩組不同孕周年齡、體重指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性，見表1。

表1 2組不同孕周流產(chǎn)患者一般資料比較(±s)

表1 2組不同孕周流產(chǎn)患者一般資料比較(±s)

注:試驗(yàn)組為多囊卵巢綜合征，對(duì)照組為正常妊娠要求流產(chǎn)者

一般資料 孕3～5周(n=41)試驗(yàn)組(n=22) 對(duì)照組(n=19)孕6～8周(n=53)試驗(yàn)組(n=28) 對(duì)照組(n=25)孕9～11周(n=51)試驗(yàn)組(n=27) 對(duì)照組(n=14)0.92 28.70 ±0.85 29.60 ±0.77體重指數(shù)(kg/m2) 24.40 ±0.33 23.80 ±0.31 24.70 ±0.32 24.60 ±0.2年齡(歲) 28.20 ±0.76 27.60 ±0.82 29.90 ±0.88 28.90 ±9 25.70 ±0.22 25.90 ±0.23

1.2 主要試劑 人睪酮(eestosterone)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒96T，glycodelin ELISA試劑盒96T，人性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)ELISA試劑盒96T均購自美國Beckman公司。以上試劑盒不與其他細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。板內(nèi)、板間變異系數(shù)均＜10%。山羊抗人glycodelin抗體(美國Abcam公司)，兔抗山羊辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(美國Cell Signaling Technology公司)，BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊生物公司)，PVDF膜(Millipore公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 母體外周血中g(shù)lycodelin水平:兩組均在黃體中期于清晨空腹抽取靜脈血5 ml，置于抗凝管中，3000 r/min離心 10 min，分離上層血清并置于－20℃冰箱保存待測。抽血時(shí)測量身高和體重，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。采用ELISA法檢測glycodelin、空腹胰島素(fasting insulin)、空腹血糖(fasting glucose)、睪酮(total testosterone)、游離睪酮(free testosterone)和SHBG水平。

1.3.2 蛻膜組織中g(shù)lycodelin蛋白表達(dá):應(yīng)用Western blot方法檢測蛻膜組織中g(shù)lycodelin蛋白的表達(dá)情況。取兩組冷凍的蛻膜組織，加入冰冷細(xì)胞裂解液后經(jīng)機(jī)械勻漿，取上清液分裝置－80℃保存?zhèn)溆?。另?0 μl上清液用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃冷庫恒流150 mA、3 h電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，奶粉封閉后加入glycodelin一抗4℃過夜，漂洗后1∶5000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊二抗37℃、2 h，ECL增強(qiáng)發(fā)光試劑顯色后，置暗盒曝光于X膠片上，常規(guī)顯影、定影。數(shù)碼相機(jī)照相，使用Gel-pro凝膠分析軟件，測定各條帶的平均光密度值(OD值)，以O(shè)D值代表蛋白質(zhì)的表達(dá)量。待測蛋白質(zhì)表達(dá)量與內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比，表示蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 母體外周血中g(shù)lycodelin水平 孕3～5周、孕6～8周、孕9～11周母體外周血中g(shù)lycodelin水平試驗(yàn)組分別為 420.0 ±27.1、443.2 ±26.2、700.3 ±25.8;對(duì)照組分別為 876.1 ± 28.2、598.9 ± 19.8、668.6±20.1，試驗(yàn)組孕3～5周和孕6～8周母體外周血中g(shù)lycodelin的水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但孕9～11周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.21)。見圖1。

圖1 2組流產(chǎn)患者母體外周血中人妊娠相關(guān)蛋白表達(dá)水平

2.2 蛻膜組織中g(shù)lycodelin蛋白的表達(dá) 將β-actin作為內(nèi)參照，試驗(yàn)組蛻膜組織中g(shù)lycodelin蛋白的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(圖2A)。孕3～5周、孕6～8周和孕9～11周蛻膜組織中g(shù)lycodelin蛋白檢測結(jié)果試驗(yàn)組分別為 0.93 ± 0.07、1.01 ± 0.11、1.33 ±0.15;對(duì)照組分別為 1.34 ± 0.12、1.33 ± 0.09、1.62±0.13，試驗(yàn)組顯著低于同孕周對(duì)照組(P ＜0.05)。見圖2B。

圖2 2組流產(chǎn)患者蛻膜組織中人妊娠相關(guān)蛋白表達(dá)水平

2.3 代謝性指標(biāo) 空腹血清胰島素水平試驗(yàn)組孕3～5周和孕9～11周顯著高于同孕周對(duì)照組(P＜0.01)，但孕6～8周與同孕周對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)?？崭寡窃囼?yàn)組孕3～5周顯著高于同孕周對(duì)照組(P＜0.01)，但孕6～8周和孕9～11周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。不同孕周試驗(yàn)組睪酮和游離睪酮均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，而SHBG水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。見表2。

表2 2組不同孕周流產(chǎn)患者代謝性指標(biāo)比較(±s)

表2 2組不同孕周流產(chǎn)患者代謝性指標(biāo)比較(±s)

注:試驗(yàn)組為多囊卵巢綜合征，對(duì)照組為正常妊娠要求流產(chǎn)者;與同孕周對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

一般資料 孕3～5周(n=41)試驗(yàn)組(n=22)對(duì)照組(n=19)孕6～8周(n=53)試驗(yàn)組(n=28)對(duì)照組(n=25)孕9～11周(n=51)試驗(yàn)組(n=27)對(duì)照組(n=14)空腹胰島素(mU/L) 24.5 ±1.2b 3.7 ±1.3 11.0 ±1.4 7.9 ±1.4 20.1 ±1.2b 6.7 ±1.3空腹血糖(mmol/L) 5.7 ±0.3b 3.6 ±0.2 4.2 ±0.3 4.0 ±0.3 4.6 ±0.3 4.2 ±0.2睪酮(nmol/L) 4.8 ±0.9b 1.9 ±1.2 4.0 ±1.1b 2.1 ±1.1 4.4 ±1.1b 2.5 ±1.0游離睪酮(pmol/L) 25.1 ±1.1b 7.1 ±1.2 13.2 ±1.1b 4.7 ±0.9 13.2 ±1.0b 5.7 ±1.2性激素結(jié)合球蛋白(nmol/L) 227.9 ±16.0a 313.5 ±18.1 417.7 ±28.9a 550.9 ±26.9 440.8 ±21.2a 561.3 ±24.1

3 討論

近年來，glycodelin與PCOS的發(fā)病機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)。glycodelin是一類糖蛋白，最初從胎盤中提取并命名為胎盤蛋白14，但是目前還沒有證據(jù)證明胎盤能夠分泌這種蛋白，因其特有的寡糖結(jié)構(gòu)從而更名為glycodelin。有研究表明，經(jīng)卵巢甾體激素處理后，glycodelin誘導(dǎo)胚胎種植增強(qiáng)［6］，而當(dāng) Glycodelin不表達(dá)時(shí)，種植幾乎完全被阻斷，提示glycodelin是植入的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白［7］。同時(shí)，glycodelin具有免疫抑制作用，胎兒攜帶來自父方的遺傳物質(zhì)，glycodelin阻止母體把胚胎當(dāng)作外來抗原進(jìn)行排斥的調(diào)節(jié)因子之一［8］。因此，glycodelin在子宮內(nèi)膜的周期性表達(dá)、受精、著床、妊娠和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的作用。

既往關(guān)于PCOS流產(chǎn)的研究多集中在卵巢水平或是針對(duì)普通流產(chǎn)患者絨毛與胎兒的生長發(fā)育的關(guān)系［9-10］。而關(guān)于母體外周血及蛻膜組織glycodelin水平與PCOS患者流產(chǎn)的相關(guān)研究卻很少。本研究發(fā)現(xiàn)孕3～8周流產(chǎn)的PCOS患者，其血清glycodelin水平顯著低于正常婦女，而孕9～11周流產(chǎn)的PCOS患者血清中g(shù)lycodelin水平與正常婦女比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，外周血中低水平的glycodelin可能與PCOS患者流產(chǎn)密切相關(guān)，因?yàn)間lycodelin可以抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和自然殺傷細(xì)胞的活性，而當(dāng)glycodelin水平降低時(shí)母體會(huì)對(duì)胚胎或胎兒產(chǎn)生免疫反應(yīng)。因此，血清中低濃度glycodelin不利于受精卵著床和維持妊娠的子宮內(nèi)膜環(huán)境。妊娠早期glycodelin是蛻膜組織的主要產(chǎn)物，有研究表明，glycodelin在妊娠最初8周分泌最多，在流產(chǎn)時(shí)，glycodelin表達(dá)的減少可以激活母體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致對(duì)發(fā)育中胎兒的排斥［11］。已有研究證實(shí)，流產(chǎn)婦女蛻膜組織中g(shù)lycodelin的表達(dá)顯著低于正常妊娠婦女［12］。在本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測了母體蛻膜組織中g(shù)lycodelin蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，PCOS患者母體蛻膜組織中g(shù)lycodelin的表達(dá)在不同孕周均顯著低于正常婦女。

高胰島素血癥和高雄激素水平是PCOS患者的特征性改變。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組外周血中孕3～5周和孕9～11周空腹胰島素水平顯著高于對(duì)照組，但在妊娠孕6～8周2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)組不同孕周外周血中睪酮水平顯著高于對(duì)照組，而SHBG水平顯著低于對(duì)照組，由此帶來的綜合效應(yīng)是PCOS流產(chǎn)患者游離睪酮明顯高于正常對(duì)照組。SHBG主要來源于人體的肝臟，高胰島素血癥、高雄激素以及糖皮質(zhì)激素均可抑制SHBG的產(chǎn)生［13］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在 PCOS患者外周血中SHBG水平顯著降低，這可能是高胰島素血癥產(chǎn)生的結(jié)果，一方面高胰島素血癥可以直接抑制肝臟生成SHBG，另一方面高胰島素通過促進(jìn)皮質(zhì)醇的產(chǎn)生從而間接抑制SHBG生成。

綜上所述，在孕3～8周中PCOS患者血清中g(shù)lycodelin水平顯著降低，妊娠前3個(gè)月中PCOS患者蛻膜組織中g(shù)lycodelin水平顯著降低，提示PCOS患者早期流產(chǎn)與子宮內(nèi)膜上皮及間質(zhì)功能障礙密切相關(guān)，胰島素抵抗可能是流產(chǎn)發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而高雄激素可能通過胰島素抵抗這一中間環(huán)節(jié)對(duì)PCOS患者流產(chǎn)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為進(jìn)一步探究PCOS患者的流產(chǎn)機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)，血清glycodelin可能用于鑒定婦女流產(chǎn)的危險(xiǎn)因素。在妊娠期間，增加血清glycodelin濃度，可能被證實(shí)有助于預(yù)防正常婦女與PCOS患者的流產(chǎn)，以及其他類型的高胰島素血癥不孕。

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