Midkine在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義

尚培中，李曉武，蔡大偉，溫艷春，谷化平，高占明

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，起病隱匿，癥狀和體征缺乏特異性，早期診斷困難，確診時大多已屬中晚期，手術(shù)切除率較低，5年生存率不足5%，其高病死率與高侵襲、轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)［1-3］。研究證實，Midkine在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用［4-6］。本研究應(yīng)用免疫組化 EliVisionTMplus法對胰腺癌組織進行Midkine檢測，旨在探討其表達與胰腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，為指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)，為判斷預(yù)后提供客觀標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集解放軍251醫(yī)院2000年3月1日—2010年2月28日胰腺癌根治性手術(shù)切除標(biāo)本70例，男44例，女26例;年齡33～79歲，平均62.3歲。均經(jīng)組織病理學(xué)診斷為原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌，其中高、中、低分化腺癌分別為25例、26例和19例;同時選取距腫瘤至少3 cm以上癌旁非腫瘤胰腺柔軟組織標(biāo)本15例。所有病例均無其他嚴(yán)重內(nèi)科疾病或其他惡性腫瘤，術(shù)前未行化療、放療及免疫治療。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(International Union for Cancer Control，UICC)第6 版標(biāo)準(zhǔn)［7］進行 TNM 分期。

1.2 方法 手術(shù)標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)制備4 μm厚切片，65℃烘烤備用。采用微波 －枸櫞酸鈉緩沖液修復(fù)抗原。兔抗人Midkine多克隆抗體、EliVisionTMplus免疫組化染色試劑盒、DAB顯色液均購自邁新生物技術(shù)有限公司。免疫組化染色采用EliVisionTMplus法，染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。用隨試劑所附已知陽性對照片做陽性對照，癌旁胰腺組織標(biāo)本做陰性對照，PBS溶液代替一抗做空白對照。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 在未知患者臨床資料的情況下，由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師獨立對染色切片進行觀察并確認(rèn)。在400倍光學(xué)顯微鏡下對每張切片任選5個視野進行觀察。背景染色清晰，陽性細胞占細胞總數(shù)比率＞5%為陽性，≤5%為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行分析。Midkine表達與胰腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系應(yīng)用χ2檢驗，Kaplan-Meier法描繪生存曲線。α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Midkine在不同胰腺組織中的表達 在胰腺癌細胞中Midkine陽性反應(yīng)主要定位于細胞質(zhì)內(nèi)，見圖1A。15例癌旁胰腺組織中均未見Midkine表達，見圖1B。Midkine在70例胰腺癌組織中陽性表達50例，陽性率為71.4%，陽性率顯著高于癌旁胰腺組織(χ2=26.02，P ＜0.05)。

圖1 Midkine在胰腺癌組織、癌旁胰腺組織中的表達(EliVisionTMplus法×200)

2.2 Midkine表達與胰腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系在性別、發(fā)病年齡及腫瘤生長部位方面，Midkine表達陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);但在腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，Midkine表達陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 Midkine表達與預(yù)后的關(guān)系 隨訪3年，1年累計總體生存率(overall survival，OS)為 40.0%(28/70)。其中，Midkine陽性患者1年累計生存率為19.6%，中位生存時間10個月，Midkine陰性患者1年累計生存率為79.2%，中位生存時間18個月。Midkine陰性患者預(yù)后明顯好于陽性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.19，P ＜0.05)，見圖2。

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的本質(zhì)特征，也是影響患者預(yù)后的一個重要因素。細胞過度增殖和凋亡受抑制是侵襲和轉(zhuǎn)移的主要機制，其能力強弱與癌基因的表達有關(guān)［8］。Midkine是1988年Kadomatsu等用差異雜交方法在視黃酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎瘤細胞cDNA文庫中篩選出的一種基因，它與多向因子(pleiotrophin，PTN)共同組成一個新的肝素結(jié)合生長因子(HBGFs)家族。由于其獨特的結(jié)構(gòu)、特殊的組織分布與抗凋亡、促血管新生等生物學(xué)功能，引起了腫瘤研究工作者的濃厚興趣，使其成為目前研究的熱點之一。Midkine在多種腫瘤組織內(nèi)，如腦腫瘤、口腔鱗狀細胞癌、唾液腺腫瘤、甲狀腺癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、胃腸道間質(zhì)瘤、肝細胞癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮頸癌中表達水平異常升高，與腫瘤發(fā)展的進程及嚴(yán)重程度密切相關(guān)，被認(rèn)為是一種多腫瘤的通用抗原［4-6，9-16］。

表1 Midkine表達與胰腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

圖2 Midkine表達陽性組與陰性組胰腺癌患者生存曲線

有關(guān)Midkine在胰腺癌組織中的表達有許多學(xué)者進行了研究。Yoshida等［17］采用Northern印跡技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中Midkine呈陽性表達，而正常成人組織中幾乎無表達。徐軍等［18］采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRTPCR)技術(shù)，對Midkine mRNA分別進行定性和定量測定，發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中Midkine mRNA表達明顯高于癌旁組織。馬松林等［19］應(yīng)用免疫組化SP法對比研究了Midkine及核增殖標(biāo)志物Ki-67在胰腺癌及正常胰腺組織中的表達，發(fā)現(xiàn)Midkine表達與腫瘤組織學(xué)分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，認(rèn)為Midkine可能發(fā)揮了促進腫瘤細胞增殖和抑制凋亡的作用。筆者應(yīng)用免疫組化EliVisionTMplus法對比觀察了胰腺癌和癌旁胰腺組織中Midkine的表達狀況，發(fā)現(xiàn)其在胰腺癌組織中陽性率為71.4%，而在癌旁胰腺組織中均呈陰性表達，證實其在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，Midkine陽性表達與性別、年齡及胰腺癌生長部位無顯著相關(guān)性，但與腫瘤大小、分化程度、臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示Midkine表達與胰腺上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。Midkine在腫瘤細胞中表達越強，其惡性程度也隨之增高，癌細胞更容易侵襲周圍組織或發(fā)生轉(zhuǎn)移，表明它是促進胰腺癌發(fā)生和發(fā)展的基因，其高表達是預(yù)后不良的標(biāo)志。本組Midkine陰性表達的20例術(shù)后總體累積生存率明顯高于陽性表達的50例，說明監(jiān)測Midkine表達狀況有助于更準(zhǔn)確地估測預(yù)后。

在各種惡性腫瘤細胞中，Midkine基因呈高強度、高頻率表達，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示Midkine有可能成為腫瘤基因治療的新靶點。通過基因藥物阻斷Midkine表達，抑制其作用途徑，可以達到促進腫瘤細胞凋亡的目的。由于Midkine基因在腫瘤組織中優(yōu)先表達，Midkine啟動因子能被用于選擇性地表達腫瘤中的有害基因，如將胰腺癌Midkine基因5＇調(diào)控區(qū)域長約609對堿基的基因片斷經(jīng)單純皰疹病毒胸苷激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)后，顯著提高了癌細胞對藥物前體及更昔洛韋的敏感性，從而影響腫瘤生長，故可將該段基因作為一種自殺基因片段［17，20］。Takei等［21］根據(jù)Midkine的二維結(jié)構(gòu)設(shè)計了硫化磷酸酯修飾的反義寡脫氧核糖核苷酸(antisense oligodexynucleotides，asODN)，在體外和動物實驗中用于鼠結(jié)腸癌細胞及神經(jīng)纖維瘤細胞等腫瘤基因治療，發(fā)現(xiàn)可明顯抑制細胞增生及瓊脂集落形成;將細胞種植于裸鼠，所形成的腫瘤明顯小于對照組。Midkine asODN主要是通過適度抑制腫瘤細胞的有絲分裂及腫瘤的血管生成來抑制腫瘤的生長，此項實驗提示Midkine asODN將來可能成為基因治療的靶向藥物之一。Inoh等［22］將阿霉素結(jié)合的抗 Midkine單克隆抗體與阿霉素共軛控制免疫球蛋白G進行對比研究，發(fā)現(xiàn)前者對人肝癌細胞(HepG2)生長的抑制作用強于后者，但其對胰腺癌的作用如何尚待進一步研究。

綜上所述，Midkine在癌旁胰腺組織中呈陰性表達，而在胰腺癌組織中多呈陽性表達。腫瘤越大、分化程度越低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越早，患者的生存期越短，Midkine表達越強，說明Midkine與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。術(shù)后通過對胰腺癌組織、特別是手術(shù)切緣的免疫組化Midkine檢測，有助于判斷胰腺癌的生物學(xué)行為及患者預(yù)后，對指導(dǎo)臨床開展多學(xué)科綜合治療具有一定實用價值。

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