CD55蛋白的表達(dá)在大鼠神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制中的作用

朱海娟，王金保

前期研究證實(shí)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角發(fā)生補(bǔ)體異常激活，且此處高表達(dá)的補(bǔ)體蛋白在動(dòng)物模型痛覺(jué)過(guò)敏的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用［1-3］。為了探索CD55蛋白作為重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，在神經(jīng)病理性疼痛(NPP)的發(fā)病過(guò)程中是否發(fā)揮作用，本研究制作NPP大鼠慢性坐骨神經(jīng)縮窄損傷模型(CCI)、保留性脊神經(jīng)損傷模型(SNI)，測(cè)定大鼠脊髓中CD55蛋白表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 60只健康清潔級(jí)SD大鼠(河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):冀醫(yī)動(dòng)管字703058號(hào))，雄性，體重200～250 g。隨機(jī)分為假手術(shù)組、CCI組、SNI組3組，每組20只。室溫(20±2)℃，嚴(yán)格12 h明暗交替光照，給予充足的水源和飼料。適應(yīng)環(huán)境7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)均在白天進(jìn)行，大鼠的使用和喂養(yǎng)嚴(yán)格遵照河北醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)和動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)所規(guī)定的有關(guān)條款執(zhí)行。

1.2 主要儀器和試劑 儀器:RTY-1型熱痛刺激儀(第四軍醫(yī)大學(xué)生理教研室研制);BME-403型Von frey機(jī)械刺激儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供);BB16uv型CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司生產(chǎn));恒溫?fù)u床(重慶醫(yī)用器材廠生產(chǎn));Gel Doc 2000凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn))。試劑:兔抗大鼠CD55多克隆抗體，批號(hào):CD55(H-319):sc-9156，美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn);辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)親和純化二抗，購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 模型的制作 制作大鼠CCI和SNI模型:①CCI模型:大鼠俯臥位捆綁，從后肢上部切開(kāi)皮膚，分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)主干，使用羊腸線環(huán)繞坐骨神經(jīng)主干并單結(jié)固定，羊腸線應(yīng)能夠在坐骨神經(jīng)主干上滑動(dòng)。②SNI模型:于大鼠后肢上緣切開(kāi)皮膚，分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)主干及其下的分支——脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓腸神經(jīng)，結(jié)扎并剪斷脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，保留細(xì)小的腓腸神經(jīng)，并避免損傷［4］。假手術(shù)組:大鼠只暴露坐骨神經(jīng)，不予結(jié)扎，然后逐層縫合。

1.4 行為學(xué)測(cè)定 分別在術(shù)前、術(shù)后1 d、3 d和7 d進(jìn)行痛閾值測(cè)定。

1.4.1 熱痛閾測(cè)定:用RYT-1型熱痛刺激儀測(cè)大鼠熱縮足潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)。參照文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行，于上午8:00～12:00測(cè)定，先將大鼠放在熱刺激儀的玻璃操作臺(tái)上適應(yīng)5 min，調(diào)節(jié)光強(qiáng)度，單次照射時(shí)間不超過(guò)30 s，以免造成熱輻射損傷，每肢照射3次，取其平均值。為避免或減少一次刺激對(duì)隨后刺激效應(yīng)造成的影響，同一部位刺激的間隔時(shí)間為5 min。

1.4.2 機(jī)械痛閾測(cè)定:參照文獻(xiàn)［6］的方法測(cè)定機(jī)械縮足閾值(PWMT)，將大鼠置于升高的金屬網(wǎng)上，并蓋以透明的有機(jī)玻璃罩，適應(yīng)20 min，用不同壓力的纖維絲(從小到大)垂直刺激其足底2、3跖趾間皮膚敏感處，逐漸加壓使之成為S形并持續(xù)6～8 s，觀察是否出現(xiàn)縮足反應(yīng)，大鼠在刺激時(shí)間內(nèi)或在移開(kāi)Von frey纖維時(shí)立即出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，記為陽(yáng)性反應(yīng)，而身體活動(dòng)所引起的縮足反應(yīng)不記作陽(yáng)性反應(yīng)。每次間隔5 s，連續(xù)10次，誘發(fā)4～6次縮足反應(yīng)作為50%反應(yīng)率，其壓力值即為閾值。

1.5 免疫組化染色 采用SP法對(duì)大鼠脊髓標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，經(jīng)左心室灌注200 ml生理鹽水和300 ml 4%多聚甲醛溶液，充分固定后，縱向剖開(kāi)椎管，取腰4～6脊髓組織，固定 24 h，經(jīng)脫水、透明，石蠟包埋切片，切片厚度為4 μm。石蠟切片經(jīng)二甲苯透明，常規(guī)梯度乙醇脫蠟，浸入0.01 mol/L、pH值為6.0的枸櫞酸鹽溶液中，加熱至98℃進(jìn)行抗原修復(fù)30 min，3%H2O2去離子水室溫孵育20 min，正常兔血清封閉液室溫孵育20 min。滴加兔抗大鼠CD55多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜，同時(shí)用PBS代替兔抗大鼠CD55多克隆抗體作為陰性對(duì)照。PBS液充分洗滌后，加入辣根酶標(biāo)記兔抗山羊 IgG 37℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，透明、封片。在OLYPUS顯微鏡下觀察，胞膜和胞質(zhì)中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，以CD55陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，以其平均值作為一個(gè)標(biāo)本的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))表示各切片CD55蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 Western blot檢測(cè) 采用Western blot法測(cè)定大鼠脊髓背角CD55蛋白的表達(dá)。于術(shù)后第7天處死大鼠取腰4～6段脊髓背角，將少量組織置于1.5 ml EP管中，加入裂解液，超聲勻漿，4℃下14000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg蛋白上樣品，8%(w/v)SDS-PAGE 電泳，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。印跡膜片用5%脫脂奶粉封閉1 h，大膜片加入抗大鼠CD55單克隆抗體，小膜片加入羊抗actin抗體，4℃過(guò)夜。用 Tris/0.05%吐溫 －20(TBST)洗膜(5 min×3)，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(山羊抗鼠 IgG)，37℃孵育1 h，TBST充分洗膜(5 min×3)，TBS洗膜10 min。最后印跡膜片與強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑ECL溫浴l min，X光膠片曝光30～60 s，經(jīng)顯影和定影顯示特異的蛋白信號(hào)。大膜片經(jīng)膜再生液再生(37℃孵育30 min)后孵育鼠抗NR2B抗體，程序同前。信號(hào)條帶掃描后，用Quantity one 4.5.0圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，以與β-actin條帶的光密度比值反映CD55蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組內(nèi)采用t檢驗(yàn)、組間采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 痛閾值情況 與術(shù)前相比，術(shù)后1 d 3組大鼠PWTL和PWMT都降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。術(shù)后第3、7天CCI組、SNI組與術(shù)前及假手術(shù)組同時(shí)點(diǎn)比較PWTL和PWMT持續(xù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而假手術(shù)組大鼠痛閾值逐漸恢復(fù)到術(shù)前水平，見(jiàn)表1。

2.2 脊髓背角免疫組化染色結(jié)果 假手術(shù)組脊髓背角陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(16±4)個(gè)，CCI組(6±2)個(gè)，SNI組(10±3)個(gè)。假手術(shù)組明顯多于 CCI組和SNI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。SNI組與CCI組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖1、2。

2.3 Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 β-actin條帶的光密度積分(IOD)一致，即總蛋白上樣量一致。假手術(shù)組大鼠脊髓背角 CD55表達(dá)量為1.15±0.26，CCI組為0.37 ±0.19，SNI組為 0.51 ±0.22。與假手術(shù)組相比，CCI組、SNI組大鼠脊髓背角CD55表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖3。

表1 3組大鼠痛閾值比較(±s)

表1 3組大鼠痛閾值比較(±s)

注:與本組術(shù)前相比，aP＜0.05;與假手術(shù)組同時(shí)點(diǎn)相比，cP＜0.05

組別 鼠數(shù) 熱縮足潛伏期(s)機(jī)械縮足閾值(g)假手術(shù)組20術(shù)前 17.3 ±2.5 14.2 ±1.9術(shù)后1 d 13.7 ±1.7a 9.5 ±3.1a術(shù)后3 d 16.6 ±2.3 13.8 ±2.8術(shù)后7 d 16.8 ±2.2 13.7 ±2.5慢性坐骨神經(jīng)縮窄損傷模型組 20術(shù)前 17.5 ±1.9 14.8 ±3.2術(shù)后1 d 12.8 ±3.2a 7.6 ±1.9a術(shù)后3 d 11.6 ±2.1ac 8.8 ±2.5ac術(shù)后7 d 11.9 ±3.0ac 8.2 ±1.4ac保留性脊神經(jīng)損傷模型組 20術(shù)前 17.7 ±2.9 13.9 ±2.0術(shù)后1 d 14.0 ±2.2a 7.8 ±1.5a術(shù)后3 d 12.8 ±1.8ac 7.4 ±2.2ac術(shù)后7 d 13.4 ±3.5ac 7.8 ±1.7ac

圖1 3組大鼠脊髓背角CD55陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況(SP×400)

圖2 3組大鼠脊髓背角CD55陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)柱狀圖

圖3 3組大鼠脊髓背角CD55蛋白的表達(dá)情況

3 討論

正常情況下，體內(nèi)產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，以特定的方式與補(bǔ)體相互作用，使補(bǔ)體的激活和抑制處于平衡狀態(tài)。補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白包括可溶性蛋白和膜結(jié)合型蛋白兩類?？扇苄缘鞍装–1抑制物、C4結(jié)合蛋白、H因子、I因子、S蛋白等，主要在血清中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用;膜結(jié)合型補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白包括膜輔助蛋白(CD46)、CD55、調(diào)節(jié)素(CD59)及補(bǔ)體受體1等，前三者主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，防止自身組織遭受補(bǔ)體攻擊［7-8］。

CD55蛋白表達(dá)于所有外周血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和黏膜上皮細(xì)胞表面，可同C2競(jìng)爭(zhēng)與C4b的結(jié)合，從而抑制C4b2b形成并促進(jìn)其分解，也可促進(jìn)Bb從已形成的C3bBb中解離［9-10］。CD55蛋白作為補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的開(kāi)始就發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其在補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白家族中地位顯著，意義重大。

關(guān)于補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究已有大量報(bào)道。Bonifati［11］報(bào)道 CD55表達(dá)下調(diào)是帕金森患者腦內(nèi)補(bǔ)體異?；罨闹匾蛩?。Emmerling［12］指出補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)異常是海默森患者發(fā)病的元兇。但補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在NPP中的研究尚屬首次。前期研究表明，在NPP形成過(guò)程中脊髓背角發(fā)生異常的補(bǔ)體活化，許多補(bǔ)體蛋白表達(dá)增高。為了增加本項(xiàng)研究的可靠性和重復(fù)性，本研究建立了兩種外周損傷型NPP模型，采用目前測(cè)定大鼠痛閾值的可靠技術(shù)熱痛刺激方法和機(jī)械痛刺激方法評(píng)估動(dòng)物模型的穩(wěn)定性，于建模后第7天斷頭處死大鼠，采用免疫組化技術(shù)和免疫印跡技術(shù)對(duì)模型大鼠脊髓中的CD55蛋白進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，兩種NPP模型脊髓中CD55蛋白水平在建模后表達(dá)發(fā)生了不同程度的降低，與假手術(shù)組相比有顯著差異。本研究結(jié)果與前期我們發(fā)現(xiàn)NPP時(shí)脊髓背角發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)是一致的。當(dāng)外周神經(jīng)發(fā)生損傷時(shí)，痛覺(jué)信號(hào)傳入中樞，脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞活化，表達(dá)大量補(bǔ)體蛋白，進(jìn)而觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)［13-15］。正常情況下，由于細(xì)胞膜上表達(dá)的CD55蛋白可干擾C3轉(zhuǎn)化酶和C5轉(zhuǎn)化酶，阻斷補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，保護(hù)自身細(xì)胞免受傷害。當(dāng)CD55缺乏或表達(dá)下調(diào)時(shí)，補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)加劇，大量膜攻擊復(fù)合物形成，攻擊鄰近的神經(jīng)元，使其內(nèi)部構(gòu)象改變，從而將傷害性信號(hào)上傳，經(jīng)過(guò)大腦的信息整合，形成痛覺(jué)過(guò)敏。因此可以推測(cè)，NPP模型大鼠脊髓中CD55的表達(dá)下降可能是此處發(fā)生補(bǔ)體異常活化的原因，至少是觸發(fā)因素之一。而有關(guān)NPP時(shí)脊髓中補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD55表達(dá)下調(diào)的機(jī)制需要做進(jìn)一步研究。

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