原發(fā)性肝癌高表達(dá)抗原GPC-3的HLA-A2限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

雷俊華，曾江正，郝新寶，蘇群豪，洪 濤，何志惠，黃 芬

目前資料表明，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC-3)不僅是診斷原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)特異性及敏感性較高的腫瘤標(biāo)記物，而且作為一種分泌型癌蛋白，與HCC發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，有可能作為細(xì)胞免疫治療的作用靶點(diǎn)［1-2］。表位是引起免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)的基本單位，確定特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的表位對(duì)于研究細(xì)胞免疫機(jī)制、過程以及研制多肽疫苗和基因疫苗等具有重要意義。在所有HLA基因型中，HLA-A2是在人群中最普遍表達(dá)的等位基因，因此由HLA-A2分子遞呈的腫瘤抗原肽表位誘導(dǎo)的CTL在腫瘤細(xì)胞免疫治療中具有重要意義［3］。表位預(yù)測(cè)的過程是根據(jù)不同環(huán)節(jié)聯(lián)合應(yīng)用多種表位預(yù)測(cè)方法如BIMAS、SYFPEITHI等獲得候選表位。本研究采用超基序、量化基序法及NetCTL數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)分析法對(duì)靶抗原GPC-3 HLA-A2限制性CTL表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，為針對(duì)GPC-3表位的細(xì)胞靶向免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料 GPC-3基因組位于人染色體Xq26.1，全長大于900 kb。從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站獲取人GPC3蛋白的氨基酸全長序列580 aa，其編碼的蛋白質(zhì)序列如下:magtvrtacl vvamllsldf pgqaqppppp pdatchqvrs ffqrlqpglk wvpetpvpgs dlqvclpkgp tccsrkmeek yqltarlnme qllqsasmelkfliiqnaav fqeafeivvr haknytnamf knnypsltpq afefvgefft dvslyilgsd invddmvnel fdslfpviyt qlmnpglpds aldineclrg arrdlkvfgn fpklimtqvs kslqvtrifl qalnlgievi nttdhlkfsk dcgrmltrmw ycsycqglmm vkpcggycnv vmqgcmagvv eidkywreyi lsleelvngm yriydmenvl lglfstihds iqyvqknagk ltttigklca hsqqrqyrsa yypedlfidk kvlkvahveh eetlssrrre liqklksfis fysalpgyic shspvaendt lcwngqelve rysqkaarng mknqfnlhel kmkgpepvvs qiidklkhin qllrtmsmpk grvldknlde egfesgdcgd dedeciggsg dgmikvknql rflaelaydl dvddapgnsq qatpkdneis tfhnlgnvhs plklltsmai svvcffflvh。

1.2 CTL表位的超基序法遠(yuǎn)程預(yù)測(cè) 采用SYFPEITHI抗原肽預(yù)測(cè)軟件，掃描GPC-3抗原的氨基酸序列，對(duì)GPC-3的HLA-A2限制性CTL表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)由9個(gè)氨基酸殘基組成的CTL表位。利用 Intenet網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入 SYFPEITHI主頁，選擇“Epitope prediction”進(jìn)入CTL表位預(yù)測(cè)界面，于 ＜Select MHC type＞復(fù)選框選定CTL表位限制性MHC類型為HLA-A*0201，表位肽大小選9肽，得出一系列候選表位，選擇得分大于20的表位進(jìn)一步分析。

1.3 量化基序法預(yù)測(cè) 在BIMAS預(yù)測(cè)軟件序列輸入框中輸入GPC-3序列，＜HLA molecule＞選定HLA-A*0201，表位肽大小選9肽，輸出結(jié)果確切表位數(shù)選40，運(yùn)行軟件，得出一系列候選表位。

1.4 NetCTL數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè) 進(jìn)入NetCTL數(shù)據(jù)庫主頁，預(yù)測(cè)由9個(gè)氨基酸組成的CTL表位，在supertype中分別選擇A2 supertype，將Weight on C terminal cleavage，Weight on TAP transport efficiency 和Threshold for epitope identification依次賦值0.15，0.05和0.85。輸入GPC-3氨基酸序列后然后點(diǎn)擊Submit進(jìn)行在線預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)出的數(shù)值中包括氨基酸序列位點(diǎn)(ID)、多肽序列(Sequence pep)、與HLA-Ⅰ分子的結(jié)合力(aff)、羧基端酶切效率(cle)、結(jié)合力重置值(aff rescale)、抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)效率(tap)、綜合分值(COMB)。其中將COMB值大于1.0的表位肽作為候選肽進(jìn)一步分析。

2 結(jié)果

結(jié)合超基序法與量化基序法預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇在兩種算法中均出現(xiàn)且總得分(SYFPEITHI與BIMAS得分相乘)較高的10條9肽(表1)。進(jìn)一步采用NetCTL數(shù)據(jù)庫 CTL表位的整合預(yù)測(cè)方法，ID、Sequence pep、aff、aff rescale、cle、tap 及 COMB 見表 2。

3 討論

腫瘤疫苗是腫瘤免疫治療的重要方法，可以通過腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志設(shè)計(jì)特異性的腫瘤疫苗，從而達(dá)到靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。已有研究證明，利用腫瘤疫苗有效激活特異性CTL，是實(shí)現(xiàn)腫瘤主動(dòng)免疫治療的關(guān)鍵。目前常用的腫瘤疫苗傳遞方式分別以細(xì)胞、多肽、蛋白質(zhì)、病毒載體為基礎(chǔ)。隨著對(duì)免疫應(yīng)答分子機(jī)制的深入研究，研究者已逐漸意識(shí)到機(jī)體的免疫細(xì)胞并不是針對(duì)病原體或天然抗原的整體分子，而是針對(duì)各種抗原分子中的免疫活性部分即抗原決定簇或表位，蛋白質(zhì)抗原是通過其表位而體現(xiàn)其特異性免疫。基于抗原分子的免疫干預(yù)手段已開始向表位水平過渡［4］。CTL表位作為抗腫瘤的新一代多肽疫苗，被認(rèn)為是最有希望的腫瘤細(xì)胞免疫治療方式之一［5］。

表1 SYFPEITHI法、BIMAS法預(yù)測(cè)原發(fā)性肝癌高表達(dá)抗原GPC-3的HLA-A2限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞候選表位

表2 應(yīng)用Net細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞數(shù)據(jù)庫進(jìn)行細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞候選表位整合預(yù)測(cè)

GPC-3是一種膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白，可通過結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白酶和生長因子等多種途徑參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、黏附和轉(zhuǎn)移等［6-7］。肝細(xì)胞癌變時(shí)GPC-3表達(dá)異常，上調(diào)后激活整合素(integrin)、胰島素樣生長因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)和Wnt信號(hào)通路等促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長，影響多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致肝細(xì)胞的增殖、分化及癌變［8-9］。GPC-3是激活整合素信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白之一，通過此信號(hào)通路可促進(jìn)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［10］。Ho 等［11］研究證實(shí)GPC-3在肝癌干細(xì)胞中高表達(dá)。與GPC-3全基因序列腺病毒相比，多肽疫苗沒有腺病毒載體的參與，不必考慮載體及其整合的安全性，也不必考慮全長蛋白中某些非優(yōu)勢(shì)表位或病理表位的毒性反應(yīng)，而且抗原肽長度僅8～15個(gè)氨基酸序列，體外可以合成，臨床應(yīng)用前景更廣闊［12-14］。

基序是蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸排列順序，不少屬于同一HLA家族甚至不同家族的HLA同種異性分子接納的抗原肽為具有相同或相似的錨著殘基構(gòu)成的肽基序，即超基序。根據(jù)MHC-I結(jié)合肽長度、殘基組成特征，可以有效進(jìn)行MHC-I分子結(jié)合肽的預(yù)測(cè)。SYPHETH即是根據(jù)上述原理進(jìn)行表位預(yù)測(cè)。量化基序法是應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法從大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中得出每個(gè)位置每種殘基影響肽段與某種MHC-I類分子結(jié)合的系數(shù)表或統(tǒng)計(jì)矩陣，并采用這些數(shù)據(jù)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)的一類方法的統(tǒng)稱。其原理是:在抗原肽與HLA-A2分子的結(jié)合過程中，抗原肽的側(cè)鏈效應(yīng)，主要依賴于相應(yīng)的氨基酸殘基在肽中所處的位置，而受相鄰氨基酸殘基影響較小。BIMAS即是根據(jù)上述原理進(jìn)行表位預(yù)測(cè)。以往CTL表位預(yù)測(cè)大多是基于BIMAS和SYFPEITHI數(shù)據(jù)庫，這些數(shù)據(jù)庫主要針對(duì)HLA多態(tài)性等位基因的篩選方法，并且只能預(yù)測(cè)候選表位與HLA亞型分子的結(jié)合力分值。而基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法的NetCTL 1.2Server數(shù)據(jù)庫整合了aff、cle、tap等，并且對(duì)這幾項(xiàng)分值進(jìn)行綜合評(píng)分。本文結(jié)合超基序法與量化基序法預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇在兩種算法中均出現(xiàn)且總得分較高的表位肽進(jìn)一步采用NetCTL綜合評(píng)分，得到了10個(gè)分值相對(duì)較高的表位抗原肽。因此將兩種程序的預(yù)測(cè)結(jié)果再綜合NetCTL進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)兩類不同機(jī)制預(yù)測(cè)程序的有機(jī)結(jié)合，可以提高表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率。本研究結(jié)果表明上述表位很可能為HLA-A2限制性CTL的優(yōu)勢(shì)表位，這些表位經(jīng)過進(jìn)一步鑒定可作為腫瘤細(xì)胞靶向免疫治療的基礎(chǔ)。

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