HPLC法測(cè)定樂舒洗液中苦參堿和蛇床子素

毛桂福 歐人豪 黃玉玲 龍鳳珍

1.廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院，廣西柳州 545001；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541004

樂舒洗液是廣西柳州市婦幼保健院的傳統(tǒng)制劑（批準(zhǔn)文號(hào)：桂藥制字Z02060005），其主要成分有蛇床子，苦參，黃柏，鶴虱，白鮮皮，百部，花椒等，具有抗菌，消炎，止癢，收斂，殺滅陰道滴蟲等作用。方中蛇床子為君藥，所含主要有效成分蛇床子素具有抗菌、止癢、抗變態(tài)反應(yīng)、增強(qiáng)免疫力等作用[1-2]。原標(biāo)準(zhǔn)中無主要成分含量的測(cè)定項(xiàng)，為加強(qiáng)對(duì)該制劑的質(zhì)量控制，保證制劑療效，筆者在參考有關(guān)文獻(xiàn)[3-12]的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了制劑有效成分苦參堿和蛇床子素的含量。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT四元梯度高效液相色譜系統(tǒng)（LC-20AT泵，Rheodyne 7725i型進(jìn)樣閥，SPD-20A紫外檢測(cè)器，CTO-20A柱溫箱，DGu-20A在線脫氣機(jī)，日本島津），PHS-3C型PH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超生儀器有限公司），HANGPINGFA1004型電子天平（上海天平儀器廠）。

苦參堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110 805-200508），蛇床子素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110822-200305）。甲醇、乙腈為高效液相色譜純?cè)噭疄橹卣麴s水，其他使用試劑均為分析純，樂舒洗液（柳州市婦幼保健院制劑室，批號(hào)：20120810、20120704、20120516、20110701、20110421）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）柱；柱溫30℃；流動(dòng)相為乙腈-0.2%三乙胺（磷酸調(diào)pH 7.0）梯度洗脫（0～5 min：28%乙腈，9～20 min：72%乙腈，23～28 min：28%乙腈）；流速 1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm（0～10 min）和 320 nm（10～28 min）；進(jìn)樣量為 20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取苦參堿對(duì)照品22.5 mg至容量瓶中，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取蛇床子素對(duì)照品18.4 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得蛇床子素對(duì)照品儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液置-20℃冰箱保存。臨用前，精密取蛇床子素對(duì)照品儲(chǔ)備液2.0 mL，加甲醇稀釋并定容至10 mL，即得368.0 μg/mL的蛇床子素對(duì)照品工作液；精密取該蛇床子素稀釋液1.0 mL，加甲醇稀釋并定容至10 mL，即得36.8 μg/mL的蛇床子素對(duì)照品工作液。

2.2.2 供試品溶液 樂舒洗液超聲30 min后，精密量取4 mL置10 mL具塞玻璃試管中，加0.5 mL濃氨溶液，用4 mL乙酸乙酯振搖提取1 min，2000 r/min離心1 min，分取有機(jī)相至另一個(gè)10 mL離心管中置95℃水浴氮?dú)獯蹈?，共提?次（每次4 mL）。精密加2 mL甲醇至離心管中，渦旋溶解殘?jiān)?，?.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 另按處方比例取缺苦參和缺蛇床子的藥材，按照樂舒洗液制備工藝制備缺苦參和缺蛇床子陰性樣品，再按供試品溶液制備方法操作即得缺苦參和缺蛇床子陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性

分別取陰性樣品、混合對(duì)照品及供試品溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1），結(jié)果表明，供試品色譜中苦參堿和蛇床子素保留時(shí)間分別為7.6 min和19.9 min，與對(duì)照品溶液的保留時(shí)間一致；陰性樣品在該色譜條件下對(duì)供試品測(cè)定無干擾，分離度良好。理論塔板數(shù)以苦參堿色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，以蛇床子素峰計(jì)算應(yīng)不低于30 000。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系

精密吸取苦參對(duì)照品儲(chǔ)備液、蛇床子素對(duì)照品工作液適量至同一容量瓶中，加甲醇定容至5.0 mL，配制成含苦參堿和蛇床子素分別為：1237.5和36.8、900.0和22.1、630.0和 8.8、450.0 和 3.5、315.0 和 1.4、225.0 和 0.6 μg/mL 的 系列混合對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。以對(duì)照品濃度（C）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得苦參堿、蛇床子素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為：A1=17 737C1-55 443，r=0.9998；A2=87 876C2+12 670，r=0.9999。結(jié)果表明，苦參堿和蛇床子素濃度分別在225.0～1237.5 μg/mL和0.6～36.8 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密取同一混合對(duì)照液連續(xù)進(jìn)樣6次，苦參堿和蛇床子素的RSD分別為1.0%（n=6）和0.6%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積?？鄥A和蛇床子素的RSD分別為1.1%（n=6）和4.0%（n=6），表明樣品室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果，苦參堿和蛇床子素的RSD分別為 1.4%（n=6）和 2.4%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密取4 mL已知含量的樣品9份，分別置10 mL離心管中，分別加入一定量的苦參堿、蛇床子素對(duì)照液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果苦參堿和蛇床子素的平均回率分別為97.96%和101.31%，RSD分別為3.63%和4.02%，見表1、2。

表1 苦參堿的加樣回收率

表2 蛇床子素的加樣回收率

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同批次樣品5批，按擬定方法制備各供試品溶液，分別精密吸取各溶液20 μL進(jìn)樣分析，并計(jì)算其含量，結(jié)果見表3。

表3 樂舒洗液中苦參堿、蛇床子素的含量（μg/mL）

3 討論

在流動(dòng)相的選擇中，分別嘗試用不同比例的乙腈-0.2%三乙胺做為流動(dòng)相進(jìn)行等梯度洗脫，結(jié)果表明，苦參堿和蛇床子素的極性差異較大，且該制劑雜質(zhì)多，用等梯度流動(dòng)相難以進(jìn)行分離測(cè)定。曾采用甲醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果樣品中苦參堿與其他雜質(zhì)也不易分離[3]。對(duì)不同pH值的流動(dòng)相進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明：pH值對(duì)苦參堿色譜峰影響較大，pH值過低，苦參堿出峰過快；pH值過高，苦參堿色譜峰有拖尾現(xiàn)象；流動(dòng)相pH為7.0時(shí)，分離效果最好。

文獻(xiàn)方法檢測(cè)苦參堿和蛇床子素分別采用220 nm[3-7]和320 nm[8-10]波長(zhǎng)。試驗(yàn)表明：在320 nm波長(zhǎng)下未能檢測(cè)出苦參堿色譜峰；在220 nm波長(zhǎng)下，蛇床子素色譜峰過小，與雜質(zhì)未能完全分離，且基線漂移較大。改用220 nm和320 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)，可同時(shí)完成對(duì)苦參堿和蛇床子素的分離測(cè)定。

在相同條件下比較了乙酸乙酯[10]、乙醚[11]以及乙酸乙酯-乙醚混合液（4∶1）等溶劑的提取效率，結(jié)果表明：乙酸乙酯對(duì)苦參堿的提取率最高，乙醚和乙酸乙酯對(duì)蛇床子素提取率相當(dāng)；苦參堿的堿性較大，在加濃氨條件下提取率較高；苦參堿在水中溶解度較大，因而需用乙酸乙酯提取4次。本制劑中含有明礬，沉淀較多，超聲后直接制成供試液進(jìn)行測(cè)定，蛇床子素的回收率較低；濾除沉淀后制成供試液，蛇床子素的回收率才有較大的提高，表明沉淀對(duì)蛇床子素有較大的吸附作用。

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