表阿霉素免疫納米微粒靶向抗肝癌作用的研究

楊 峰 黃國(guó)祥 袁淑儀 龐 泓 王金林 龔時(shí)文

廣東省東莞市人民醫(yī)院，廣東東莞 523126

目前原發(fā)性肝癌的治療是以手術(shù)為主的綜合治療，但總的手術(shù)切除率僅有20%～30%，且術(shù)后2年復(fù)發(fā)率高達(dá)50%[1]，因此化療依然是肝癌治療重要的輔助手段。為提高傳統(tǒng)化療藥物的療效并減少其毒副作用，靶向給藥日益成為治療肝癌的有效方法，而單克隆抗體和載藥納米微粒則是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[2－4]。筆者在前期研究中選擇生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料海藻酸鈉和陽(yáng)離子瓜爾膠，利用聚電解質(zhì)復(fù)合法制成具有良好緩釋性能的載表阿霉素納米微粒（E－ADM－NPs）[5]。 本研究將進(jìn)一步探討EADM－NPs與抗VEGFR2單克隆抗體的交聯(lián)，并觀察交聯(lián)物（E－ADM－Ab－NPs）對(duì)荷人肝癌裸鼠模型的抗腫瘤作用，以期用于原發(fā)性肝癌的靶向治療。

1 材料與方法

1.1 試劑與動(dòng)物

海藻酸鈉（溫州東升試劑廠）；陽(yáng)離子瓜爾膠（美國(guó)E-conomy公司）；鹽酸表阿霉素（法瑪西亞有限公司）；抗VEGFR2單克隆抗體（美國(guó)Biodesign公司）；碳化二亞胺（EDC）（美國(guó) Pierce 公司）；人肝癌 Bel 7402 細(xì)胞株（由中科院上海細(xì)胞生物研究所提供）；三級(jí)BALB/c裸鼠（由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）。

1.2 E-ADM-Ab-NPs的制備及抗體活性的檢測(cè)

依據(jù)文獻(xiàn)方法[5]，利用聚電解質(zhì)復(fù)合法制備E－ADMNPs和未載藥 NPs。 稱取 10 mg E－ADM－NPs和 2 mg抗VEGFR2單抗溶于pH值7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，緩慢加入5 mg EDC，4℃條件下攪拌2 h而后靜置過夜。將所得溶液離心后用蒸餾水洗滌3遍，冷凍干燥即可制得EADM－Ab－NPs。 依法制備未載藥 Ab－NPs，參考文獻(xiàn)[6]利用酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA） 對(duì)E－ADM－Ab－NPs和未載藥Ab－NPs中抗VEGFR2單抗的活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 荷人肝癌裸鼠模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌Bel 7402細(xì)胞，用含15%小牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)液按1×107/mL的濃度配成細(xì)胞懸液供皮下接種。取一定數(shù)量4～6周齡的三級(jí)BALB/c裸鼠，分別于右側(cè)肩胛部皮下種植0.1 mL細(xì)胞懸液，飼養(yǎng)2周后選擇生長(zhǎng)良好、皮下腫瘤直徑0.5～0.7 cm的裸鼠用于腫瘤治療試驗(yàn)，飼養(yǎng)6周后選擇生長(zhǎng)良好、皮下腫瘤直徑約1.0～1.2 cm的裸鼠用于藥物的組織分布試驗(yàn)。

1.4 E-ADM-Ab-NPs在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布

取體重為（20±2）g/只的荷人肝癌裸鼠12只（雌雄各半），隨機(jī)分為 E－ADM－Ab－NPs組和 E－ADM－NPs組，兩組按含E－ADM 5 mg/kg的劑量分別經(jīng)尾靜脈注射 EADM－Ab－NPs及 E－ADM－NPs。 每只裸鼠給藥后 1 h經(jīng)眼靜脈竇取血1.0 mL作樣品，然后斷頸處死裸鼠，手術(shù)分別取出腫瘤、心臟、肝臟、腎臟等組織作樣品。利用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)荷人肝癌裸鼠組織和血液中E－ADM的濃度。

1.5 E-ADM-Ab-NPs在荷瘤裸鼠體內(nèi)的抑瘤試驗(yàn)

取體重為（18±2）g/只的荷人肝癌裸鼠48只（雌雄各半），隨機(jī)分為 8組，每組 6只。A 組：E－ADM－Ab－NPs組；B 組：E－ADM－NPs組；C 組：Ab－NPs組；D 組：E－ADM 原藥加抗VEGFR2單抗組；E組：E－ADM原藥組；F組：抗VEGFR2單抗組；G組：未載藥NPs組；H組：空白對(duì)照組。各組制劑分別溶于生理鹽水中，按E－ADM每次10 mg/kg、抗VEGFR2單抗每次0.1 mg/kg的劑量經(jīng)荷瘤裸鼠尾靜脈注射，空白對(duì)照組注射生理鹽水，每隔2天給藥1次，共5次。于治療第11天斷頸處死裸鼠，取血清檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐及白細(xì)胞計(jì)數(shù)。完整剝離瘤體測(cè)量長(zhǎng)徑及短徑并稱重，用體積=（長(zhǎng)徑×短徑2）/2計(jì)算腫瘤體積，觀察瘤體積抑制率及瘤重抑制率。瘤體積抑制率=[（對(duì)照組平均瘤體積－實(shí)驗(yàn)組平均瘤體積）/對(duì)照組平均瘤體積]×100%，瘤重抑制率=[（對(duì)照組平均瘤重－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重]×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E-ADM-Ab-NPs的抗體活性

ELISA 法檢測(cè)表明，E－ADM－Ab－NPs濃度稀釋至 1∶1600時(shí)，其抗體仍表現(xiàn)出對(duì)靶抗原良好的免疫結(jié)合活性，其效價(jià)與游離抗VEGFR2單抗基本相當(dāng)。

2.2 E-ADM-Ab-NPs在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布

E－ADM－Ab－NPs組腫瘤組織中的 E－ADM 濃度為（31.85±4.78）mg/kg，其顯著高于 E－ADM－NPs組（P ＜ 0.05），而血液、心臟、肝臟、腎臟等組織中的E－ADM濃度分別為（5.21±0.49）mg/L、（4.40 ±0.33）mg/kg、（3.14 ±0.27）mg/kg、（2.38 ±0.39）mg/kg，均顯著低于 E－ADM－NPs組（P ＜ 0.05），見表1。

表1E-ADM-Ab-NPs組及E-ADM-NPs組在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布（n=6，±s）

表1E-ADM-Ab-NPs組及E-ADM-NPs組在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布（n=6，±s）

注：與 E－ADM－NPs組比較，*P ＜ 0.05

組別E－ADM 濃度血瘤（mg/kg）血液（mg/L）心臟（mg/kg）肝臟（mg/kg）腎臟（mg/kg）E－ADM－Ab－NPs組E－ADM－NPs組31.85±4.78 8.82±0.71 5.21±0.49*9.73±0.65 4.40±0.33*8.61±0.70 3.14±0.27*7.81±0.68 2.38±0.39*6.65±0.54

2.3 E-ADM-Ab-NPs對(duì)荷瘤裸鼠的抗腫瘤作用

治療11 d后與空白對(duì)照組相比，除未載藥NPs組外其余各組的腫瘤體積和重量均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。 E－ADM－Ab－NPs組的平均腫瘤體積及瘤體積抑制率為（79.17±18.63）mm3和60.69%，平均腫瘤重量及瘤重抑制率為（0.51±0.16）g和58.54%，顯示其抗腫瘤作用強(qiáng)于其他組（P ＜0.05）。 見表2、3。

表2 各組第11天的腫瘤體積和瘤體積抑制率（n=6，±s）

表2 各組第11天的腫瘤體積和瘤體積抑制率（n=6，±s）

注：與 H 組比較，*P ＜ 0.05；與 A 組比較，#P ＜ 0.05；“－”表示無(wú)數(shù)據(jù)

組別 平均腫瘤體積（mm3） 瘤體積抑制率（%）A組B組C組D組E組F組G組H組79.17±18.63*115.31±26.39*#147.36±37.21*#108.95±23.19*#121.79±29.57*#139.45±34.62*#193.52±46.86#201.35±48.17 60.69 42.74 26.82 45.90 39.52 30.75 3.89－

表3 各組第11天的腫瘤重量和瘤重抑制率（n=6，±s）

表3 各組第11天的腫瘤重量和瘤重抑制率（n=6，±s）

注：與 H 組比較，*P ＜ 0.05；與 A 組比較，#P ＜ 0.05；“－”表示無(wú)數(shù)據(jù)

G組H組1.18±0.26#1.23±0.25 4.07－

2.4 毒副作用統(tǒng)計(jì)結(jié)果

E－ADM－Ab－NPs組的血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平為（6.82±1.09）×109/L 和（40.26±15.27）U/L，與空白對(duì)照組相近，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。E－ADM原藥組及E－ADM原藥加抗VEGFR2單抗組的血白細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為（3.95±0.84）×109/L 和（4.08±0.91）×109/L，明顯低于其他組，而血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平則分別為（72.46±17.02）U/L 和（68.51±15.94）U/L，顯著高于其他組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。血肌酐水平在各組中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。 見表4。

表4 各組血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及肌酐水平比較（n=6，±s）

表4 各組血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及肌酐水平比較（n=6，±s）

注：與H組比較，*P＜0.05；與E組比較，#P＜0.05

組別 白細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L） 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（U/L） 肌酐（μmol/L）A組B組C組D組E組F組G組H組6.82±1.09#6.53±1.02#6.70±1.06#4.08±0.91*3.95±0.84*6.79±1.12#7.04±1.25#6.89±1.18 40.26±15.27#37.42±13.62#39.56±14.78#68.51±15.94*72.46±17.02*39.07±13.98#40.47±15.16#38.53±14.31 14.29±1.75 15.34±1.91 13.74±1.72 14.61±1.63 15.28±1.83 13.72±1.68 14.03±1.79 13.64±1.86

3 討論

原發(fā)性肝癌化療的總體療效一直不甚理想，傳統(tǒng)的全身靜脈化療對(duì)機(jī)體有較強(qiáng)的毒副作用，限制了化療藥物在腫瘤局部達(dá)到有效濃度，而局部化療如肝動(dòng)脈栓塞化療（TACE）等往往需要?jiǎng)?chuàng)傷性操作才能實(shí)現(xiàn)。如何在提高腫瘤組織藥物濃度的同時(shí)降低正常組織中的藥物濃度，是目前腫瘤化療研究的熱點(diǎn)，因此載藥納米微粒靶向治療具有廣闊的前景。

本研究利用聚電解質(zhì)復(fù)合法合成載E－ADM納米微粒，其載體材料海藻酸鈉的分子鏈上富含羧基和羥基，可通過化學(xué)交聯(lián)與抗VEGFR2單克隆抗體相結(jié)合，ELISA法檢測(cè)表明在E－ADM－Ab－NPs制備過程中抗體活性無(wú)明顯喪失。VEGFR2主要分布于腫瘤血管內(nèi)皮表面及原發(fā)性腫瘤細(xì)胞表面，而在正常組織及良性血管增生性組織中僅呈低水平表達(dá)，是介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在腫瘤新生血管形成中發(fā)揮功能的主要受體[7－9]。原發(fā)性肝癌組織的VEGFR2陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)60%～70%[10]，而抗VEGFR2單抗是針對(duì)VEGFR2的特異性抗體，能將化療藥物攜帶至腫瘤組織中發(fā)揮免疫靶向治療作用[11－13]。荷人肝癌裸鼠模型體內(nèi)的分布試驗(yàn)表明，E－ADM－Ab－NPs可選擇性地集中于腫瘤組織，而在血液、心臟、肝臟、腎臟等正常組織中的分布較少。E－ADM－Ab－NPs具有的良好緩釋性能可使肝癌組織較長(zhǎng)時(shí)間處于有效的藥物濃度中，同時(shí)抗VEGFR2單抗可競(jìng)爭(zhēng)性抑制VEGF與VEGFR2結(jié)合，從而抑制腫瘤血管的生成[14－15]。荷人肝癌裸鼠模型的體內(nèi)治療發(fā)現(xiàn)，E－ADM－Ab－NPs組的瘤體積抑制率和瘤重抑制率明顯高于E－ADM原藥組，有助于臨床上減少化療藥物的單次用量，并避免長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)靜脈用藥所帶來(lái)的不便。包含E－ADM原藥各組的荷瘤裸鼠血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于空白對(duì)照組，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平明顯高于空白對(duì)照組，而E－ADM－Ab－NPs組的血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平則與空白對(duì)照組相近，表明E－ADM－Ab－NPs可減少E－ADM原藥的骨髓抑制和肝功能損害等毒副作用。

綜上所述，本研究合成的E－ADM－Ab－NPs由于納米微粒的緩釋性能及抗VEGFR2單抗的導(dǎo)向作用，可明顯提高其對(duì)荷人肝癌裸鼠模型的抗腫瘤效應(yīng)，并降低E－ADM原藥的全身毒副作用，是一種安全有效的新型肝癌靶向治療制劑，具備良好的臨床應(yīng)用前景。

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