薄層掃描法測定復聰片中淫羊藿苷的含量

李 紅 蔣孟良

湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙 410208

復聰片由黃芪、丹參、淫羊藿、當歸、骨碎補、熟地黃、水蛭、炮山甲、澤瀉、石菖蒲等中藥組成，是由耳聾左磁丸加減而成[1]，能清肝膽、利濕熱、補腎活血、益氣養(yǎng)血，主要用于治療由于腎虛等病因引起的聽力下降。淫羊藿是本方中的重要組分。淫羊藿為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鮮淫羊藿等多種淫羊藿的莖葉。淫羊藿是多年生草本，味辛、甘，性溫；歸肝經(jīng)；體輕氣雄，可升可降；具有壯腎陽、堅筋骨、祛風濕等功效；主治陽痿、遺精早泄、精冷不育、尿頻失禁、腎虛喘咳、腰膝酸軟、筋骨攣急、風濕痹痛、半身不遂、四肢不仁。淫羊藿主要含黃酮類化合物、木脂素、生物堿、揮發(fā)油等。淫羊藿的葉和莖中含淫羊藿苷（icariin）、淫羊藿次苷（icariside）、去氧甲基淫羊藿苷（des-O-Methylicariin）、β-去水淫羊藿素（β-anhy-Droicaritin）、淫羊藿糖苷（epimedoside）A、B、C、D、E，淫羊藿苷是其主要有效成分之一[2]?，F(xiàn)代研究表明，淫羊藿苷具有提高性功能、抗衰老、改善免疫系統(tǒng)、增強心肌收縮力、降血壓、鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘、抗炎及抗病原微生物、改善血流動力和血液流變的作用。本實驗采用薄層掃描法[3-4]測定復聰片中淫羊藿苷的含量，方法簡便易行，并且有較好的精密度和重復性，可以用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制?，F(xiàn)將實驗結果報道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CS-930型薄層掃描儀 （日本島津）；AB135-S型電子天平（0.01 mg，METTLER TOLEDO）；DK-S22 電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；SK3300A型粉碎機（上?？茖С晝x器有限公司）；WGLL-125BE型電熱鼓風干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）；5 μL 微量進樣器（上海第三注射器廠）；索氏提取器。

1.2 試藥

復聰片（湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院）；硅膠G（青島海洋化工廠）；淫羊藿苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用）；三氯化鋁、乙醇、醋酸乙酯、丁酮、甲醇等試劑均為分析純。

2 方法及結果

2.1 薄層層析條件

2.1.1 薄層板 含0.5%羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板（10 cm×20 cm），于105℃活化1 h，置于干燥器中備用。展開劑：醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水（10∶1∶1∶1）。

2.1.2 顯色劑 5%三氯化鋁-乙醇溶液。

2.2 掃描條件[5]

單波長反射法鋸齒形程序掃描；掃描波長λ=272 nm；狹縫為1.2 mm×1.2 mm，Sx=3，靈敏度中等。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的淫羊藿苷對照品0.9 mg，用甲醇溶解并用2 mL 容量瓶定容，搖勻備用（濃度：0.45 mg/mL）。

2.4 供試品溶液的制備

取無糖衣的復聰片10 片，碾碎，置于索氏提取器中，加入50 mL 醋酸乙酯，連續(xù)回流提取至無色（約3.5 h）。將提取液水浴蒸干，用水溶解，上聚酰胺柱（層板柱為1.5 cm×20 cm，5 g 聚酰胺），先用70 mL 蒸餾水洗滌，洗滌液棄去；繼用70 mL 70%乙醇洗滌，收集乙醇洗脫液，水浴蒸干，用甲醇溶解并定容到2 mL，搖勻備用。

2.5 陰性溶液的制備

精密稱取1/10處方量的各藥物（淫羊藿除外），依照其生產(chǎn)工藝制備陰性樣品100 片，取其中10 片，按樣品供試液的方法制備陰性樣品溶液。

2.6 線性關系的考察

精密吸取對照品溶液（0.45 mg/mL）10、15、20、25、30 μL，分別點樣于同一塊薄層板上，按上述條件，依法展開，掃描測定。以點樣量（μg）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標。見表1。

表1 線性關系考察結果（n=5）

結果顯示，該條件下回歸方程：Y=4120.19X－15 458.92，相關系數(shù)：r=0.999 5，提示淫羊藿苷在 4.50～13.50 μg 范圍內(nèi)含量與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.7 同板精密度試驗

在同一塊薄層板上，分別點相同量對照品溶液15 μL的6個點，依法展開，測定其峰面積積分值，結果RSD=4.56%，表明具有較好的同板精密度。見表2。

表2 同板精密度試驗結果

2.8 異板精密度試驗

在6 塊不同薄層板上，點相同量對照品溶液15 μL 的6個點，依法展開，測定其峰面積積分值，結果RSD=5.21%，n=6，表明具有較好的異板精密度。見表3。

表3 異板精密度試驗結果

2.9 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液按文中所述含量測定方法，顯色后立即測定，然后每隔30 min 測定一次，連續(xù)測定3 h，結果RSD=3.35%，n=7，表明3 h 內(nèi)測定結果基本穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗

精密稱取已測知淫羊藿苷含量的復聰片粉末及一定量的淫羊藿苷對照品，按樣品測定方法進行測定，結果淫羊藿苷的平均回收率為98.10%，RSD 為1.31%。見表4。

表4 回收率試驗結果（n=6）

2.11 樣品含量測定

精密吸取對照品溶液15μL 和25μL，供試品溶液20μL，分別點于同一塊薄層板上，同前展開測定，采用外標兩點法計算含量。見表5。

表5 樣品含量測定結果

3 討論

耳聾指不同程度的聽力下降，耳聾又常常由耳鳴發(fā)展而來，正如《醫(yī)學入門》所說：“耳鳴乃是聾之漸也”，可從其性質(zhì)及病程進行辨證，如《景岳全書·耳證》所說：“凡暴鳴而聲大者多實；漸鳴而聲細者多虛”。隨著我國人口年齡的老齡化，老年性聾的發(fā)病率有增高的趨勢，其發(fā)病情況為城市高于農(nóng)村，工業(yè)人口高于農(nóng)業(yè)人口，心血管疾病患者高于一般居民，男性聽力減退比女性更為顯著，年齡越大，發(fā)病率越高，聽力減退也越明顯。因其病程較長，進展緩慢，故屬中醫(yī)學耳聾、久聾范疇。中老年人由于年齡增大的關系，臟腑日損，陰精暗耗，氣血漸衰，耳目功能減退，以致出現(xiàn)重聽耳鳴，甚則聾閉。中醫(yī)認為，精血不足或氣血虧損，以及久病入絡，均可致竅絡瘀阻，耳竅失養(yǎng)，功能失司。

復聰片是我校第二附屬醫(yī)院譚敬書教授治療耳聾的有效驗方，用之老年性聾療效頗佳[6]。該方以填精充髓，補益氣血，活血化瘀，通絡復聰為治則組方，療效顯著。周光源等[7]用復聰片治療中老年耳聾114例，并以耳聾左慈丸治療的78例作對照，結果，復聰片對耳骨導聽閾的總有效率為83.9%，對病程中度患者的總有效率為88.3%，均明顯優(yōu)于對照組[7]。藥理研究表明：復聰片具有支持蝸內(nèi)神經(jīng)結構的作用，這可能與促進神經(jīng)生長因子與其受體的結合以及通過保護毛細胞，間接促進神經(jīng)生長因子的產(chǎn)生有關[6]。徐紹勤等[8]對慶大霉素（GM）致豚鼠的耳毒性反應進行拮抗及治療研究。證實復聰片可減輕GM 的耳毒性反應，保護耳蝸聽毛細胞，拮抗GM 所致之聽閾升高，電鏡觀察顯示毛細胞損害減輕。對已由GM 致聾的豚鼠，復聰片可促使受損毛細胞形態(tài)及功能在一定程度上恢復，有效降低GM耳中毒豚鼠聽閾，阻止GM 停藥后遲發(fā)的聽閾升高，表明復聰片對GM 所致的豚鼠耳中毒有一定的防治作用。彭斌等[9]報道，復聰片對老年大鼠聽覺腦干誘發(fā)電位反應閾（ABR）具有明顯抑制作用，復聰片與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）[9]，復聰片對大鼠耳蝸核神經(jīng)元數(shù)量減少有明顯的抑制作用，且神經(jīng)細胞腫脹、胞核及胞漿皺縮等情況明顯較老年對照組為輕[10]。臨床與藥效試驗均證實復聰片對老年性耳聾具有良好療效。

用醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水（10∶1∶1∶1）作展開劑，在20℃以上溫度展開時，會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。這主要是由于溫度升高使展開劑黏度降低，致使展開速度過快而導致。故薄層展開的溫度應控制在15℃左右最為適宜。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，20 10：674.

[2]高學敏.中藥學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2010：494-495.

[3]林昱，李新田，邱財榮，等.薄層掃描法測定接骨丹膠囊中士的寧[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（7）：53-54.

[4]周芳禮，黃瑞松，蘇青，等.薄層掃描法測定不同產(chǎn)地喜樹果中的喜樹堿[J].華西藥學雜志，2008，23（5）：610-612.

[5]丁晨光，李修祿.淫羊藿生藥中淫羊藿苷的高效薄層掃描測定[J].藥物分析雜志，1991，11（1）：33-34.

[6]徐紹勤，劉佳運，彭斌，等.復聰片對老年大鼠蝸內(nèi)神經(jīng)結構影響的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結合耳鼻咽喉科雜志，2001，9（1）：6-8.

[7]周光源，譚奕，李凡成，等.復聰片治療中老年耳聾114例臨床觀察[J].中國中西醫(yī)結合雜志，1999，19（2）：108-109.

[8]徐紹勤，歐陽林，曾省三，等.復聰片對豚鼠慶大霉素耳中毒的防治作用[J].中藥新藥與臨床藥理，1999，10（6）：341-343.

[9]彭斌，徐紹勤，劉佳遠，等.復聰片對老年大鼠昕功能影晌的實驗研究[J].湖南中醫(yī)雜志，2003，19（1）：55.

[10]彭斌，徐紹勤，文志.復聰片對老年大鼠耳蝸核神經(jīng)元數(shù)量的影響[J].湖南中醫(yī)雜志，2009，25（4）：116-118.