基于AOTF-近紅外光譜技術(shù)的川貝母藥材即時(shí)快速鑒別研究

楊復(fù)森， 武衛(wèi)紅， 王 寧，*， 黃林芳， 董海平

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250002;2.山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東濟(jì)南250002;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京100193;4.濟(jì)南金宏利實(shí)業(yè)有限公司，山東濟(jì)南250100)

貝母為臨床常用藥，具清熱散結(jié)，化痰止咳功效。2010年版《中國(guó)藥典》［1］收載貝母類藥材包括川貝母、浙貝母、伊貝母、平貝母和湖北貝母共5大類。收載川貝母的基原植物共6種［1］，即川貝母Fritillaria cirrhosa D．Don、暗紫貝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K．C．Hsia、甘肅貝母Fritillaria przewalskii Maxim、梭砂貝母 Fritillar delavayi Franch、太白貝母Fritillaria taipaiensis P．Y．Li和瓦布貝母 Fritillaria unibracteata Hsiao et K．C．Hsia var．wabuensis(S．Y．Tang et S．C．Yue)Z．D．Liu，S．Wang et S．C．chen，其藥材按照性狀不同分別習(xí)稱“松貝” “青貝” “爐貝”和“栽培品”。

川貝母臨床用藥歷史悠久、療效確切，但正品川貝母資源匱乏，價(jià)格昂貴，在實(shí)際應(yīng)用中存在兩大問題:一是貝母類藥材均來源于百合科植物的干燥鱗莖，貝母屬植物分布廣泛，種間變異復(fù)雜外形相似，給川貝母的基原鑒定帶來極大困難;二是川貝母商品主要規(guī)格“松貝”中常摻雜價(jià)格低廉的平貝母、東貝母和珠貝等［2］，存在以次充好、以假亂真的問題。而現(xiàn)行的檢測(cè)方法中無論傳統(tǒng)鑒別方法還是現(xiàn)代研究技術(shù) (薄層色譜法、HPLC法、熱分析法、分子鑒定法［3］等)均存在操作繁瑣，分析周期長(zhǎng)，難以適時(shí)應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的問題，因此，目前亟待建立在流通領(lǐng)域中對(duì)川貝母的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)快速鑒別方法，以規(guī)范川貝母藥材市場(chǎng)及保證臨床用藥的安全有效。

便攜式聲光可調(diào)濾光器 (AOTF)-近紅外光譜儀克服了傳統(tǒng)車載近紅外光譜儀的缺點(diǎn)，為在現(xiàn)場(chǎng)適時(shí)作業(yè)提供了可能，近年來應(yīng)用于中成藥、煙草、化工等分析領(lǐng)域［4-5］。本研究基于AOTF-近紅外光譜技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立了川貝母基原鑒別方法及商品“松貝”的快速識(shí)別方法，獲得了滿意結(jié)果。

1 儀器和材料

1.1 儀器 Luminar 5030型便攜式AOTF近紅外光譜儀 (美國(guó)BRIMROSE公司)，包括:Snap!光譜采集軟件和The Unscrambler分析軟件 (挪威CAMO公司);YF111型高速中藥粉碎機(jī) (浙江省瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)。

1.2 樣品 多數(shù)收集自各貝母主產(chǎn)地，少數(shù)購于藥材市場(chǎng)，詳見表1，樣品經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所黃林芳教授和山東大學(xué)藥學(xué)院趙華英教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 近紅外光譜采集與預(yù)處理 將所有樣品置于恒溫干燥箱內(nèi)60℃干燥12 h后，粉碎，過80目篩，分別采集光譜，取約5 g粉末置于樣品槽，用盒蓋將樣品表面刮平，加蓋一起置于支架上，將光譜儀的探頭垂直卡在樣品盒蓋的圓孔處。儀器參數(shù)設(shè)置:波長(zhǎng)范圍1 100～2 300 nm、波長(zhǎng)增量2.0 nm、掃描次數(shù)300;每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次，取平均光譜。所測(cè)近紅外光譜見圖1。

為了消除基線漂移的影響，提高分辨率和靈敏度，經(jīng)比較本研究采取一階微分處理光譜數(shù)據(jù)效果較好，同時(shí)選擇平滑數(shù)為9，可達(dá)到理想效果。圖2為預(yù)處理后的吸收光譜圖。

2.2 主成分分析法快速鑒別川貝母 主成分分析法 (PCA)是一種簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)、突出主要矛盾的多元分析方法，被廣泛應(yīng)用在化學(xué)與測(cè)譜學(xué)分析中［6］。本研究首先利用該方法對(duì)所有貝母類藥材進(jìn)行分析，將預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入The Unscrambler分析軟件，進(jìn)行PCA運(yùn)算，結(jié)果以空間分布圖表示，見圖3。從川貝母6個(gè)基原品種中各隨機(jī)選取1批，共6批作為陽性驗(yàn)證集樣本，其余50批為建模集樣本，7種非貝母類藥材中各隨機(jī)選取2批，共14批作為陰性驗(yàn)證集樣本，繼續(xù)利用PCA分析方法建立川貝母類藥材的分析模型，并對(duì)驗(yàn)證集進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖4。驗(yàn)證結(jié)果可采用兩種表示方法:一是Excel表格顯示法，二是模型區(qū)域判別法，如圖4左側(cè)表格中，如果樣品編號(hào)后是空白，說明該樣品被檢測(cè)為不屬于模型內(nèi)樣品，如果樣品編號(hào)后有*號(hào)標(biāo)記，說明該樣品被檢測(cè)為屬于模型內(nèi)的樣品;圖4右側(cè)是模型分布區(qū)域圖，如果被檢測(cè)樣品x落在分析模型區(qū)域內(nèi)，說明該樣品屬于川貝母，反之，說明被檢測(cè)的樣品與建模樣品不相同，不是川貝母。

表1 貝母樣品Tab.1 Samples of Fritillaria

圖1 川貝母及其他貝母品種的近紅外原始吸收光譜圖Fig.1 Raw NIR absorption spectrum of Fritillariae cirrhosae Bulbus and other Fritillaria varieties

圖2 川貝母及其他貝母品種的近紅外一階導(dǎo)數(shù)吸收光譜圖Fig.2 First-order derivative NIR absorbance spectrum of Fritillariae cirrhosae Bu lbus and other Fritillariae species

圖3 貝母類藥材的PCA空間分布圖Fig.3 PCA spatial distribution map of Fritillaria

圖4 川貝母分析模型對(duì)非川貝母類藥材驗(yàn)證圖Fig.4 Validation figures on the non-Fritillariae cirrhosae Bulbus confirmed by Fritillariae cirrhosae Bulbus analysismodel

圖3中所示樣品前3個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為97%，能夠代表原近紅外光譜的主要信息。由樣品的空間分布情況可知，川貝類藥材 (川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母、瓦布貝母和太白貝母)空間分布區(qū)域集中，聚為一類，而其他貝母藥材 (平貝、伊貝、浙貝、東貝、湖北貝母和安徽貝母)有各自相對(duì)集中的聚集區(qū)，且各聚集區(qū)與川貝類專屬區(qū)有一定的距離，能夠進(jìn)行明確的區(qū)域識(shí)別。圖4顯示川貝母分析模型可將川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母、瓦布貝母和太白貝母正確判別為與建模樣品相同的川貝母類藥材，而平貝、伊貝、浙貝、東貝、湖北貝母和安徽貝母則判為非模型內(nèi)藥材，即不是川貝母。綜上說明該方法可將川貝母類藥材與非川貝類藥材有效區(qū)別開來。

2.3 基于暗紫貝母的6種基原川貝母品種定性分析 “松貝”是商品川貝母的主要規(guī)格，而暗紫貝母是松貝的主要來源［7］，從收集到的28批暗紫貝母中隨機(jī)選取5批作為陽性驗(yàn)證集樣本，剩余23批為建模集樣本，其他5種基原川貝母中各隨機(jī)選取3批，共15批作為陰性驗(yàn)證集樣本，利用PCA分析法建立了暗紫貝母的近紅外定性分析模型，并利用該模型對(duì)驗(yàn)證集進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果見圖5。

圖5 暗紫貝母定性分析模型對(duì)6種基原川貝母的驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Results on Fritillaria unibracteata qualitative model for verifying Fritillariae cirrhosae Bulbus from six sources

圖中顯示，陽性驗(yàn)證集均落在模型區(qū)內(nèi)，說明其與建模樣品相同，可被模型正確判別為暗紫貝母，模型的準(zhǔn)確判別率較高。陰性驗(yàn)證集中川貝母、梭砂貝母、太白貝母全部落在模型區(qū)外，說明該驗(yàn)證集樣品與建模樣品不相同，可被模型正確排除。而陰性驗(yàn)證集瓦布貝母、甘肅貝母則各有兩批落在模型區(qū)外，一批落在模型區(qū)內(nèi)，說明二者易被誤判為暗紫貝母。有研究者認(rèn)為瓦布貝母為暗紫貝母的變種［8］，而甘肅貝母和暗紫貝母的親緣關(guān)系十分密切［9］，這可能是二者被模型誤判的根本原因。

由圖5的分布情況還可看出，瓦布貝母與甘肅貝母離暗紫貝母分布區(qū)最近，川貝母次之，太白貝母和梭砂貝母最遠(yuǎn)，可推測(cè)瓦布貝母、甘肅貝母與

暗紫貝母的親緣關(guān)系最近，川貝母次之，太白貝母和梭砂貝母與暗紫貝母的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，該結(jié)果與李慶等［3］通過遺傳聚類分析方法研究報(bào)道結(jié)果一致。圖中還顯示太白貝母和梭砂貝母空間分布區(qū)域有交叉，也許是二者親緣關(guān)系接近的表現(xiàn)，這一結(jié)果還需深入研究。

2.4 “松貝”與其混偽品的快速鑒別 “松貝”價(jià)格高、資源少，藥材市場(chǎng)多見以“小平貝”、“珠貝”、 “小東貝”混充松貝。本研究利用PCA分析法建立了25批松貝 (暗紫貝母為其主要來源)的近紅外定性分析模型，經(jīng)對(duì)3批松貝作陽性驗(yàn)證，結(jié)果準(zhǔn)確，模型的判別能力良好。調(diào)用松貝模型對(duì)小平貝 (8批)、珠貝 (2批)、小東貝(2批)作驗(yàn)證，結(jié)果見圖6。

圖6 松貝定性分析模型對(duì)其混偽品的驗(yàn)證結(jié)果Fig.6 Verification results of qualitative analysis of"F．sungbei Hsiao et K．C．Hsia"on its adulterants

結(jié)果顯示，小平貝、珠貝和小東貝均落在所建模型區(qū)之外，說明驗(yàn)證集樣品與建模樣品不相同，可被模型正確排除，即不是松貝。

3 小結(jié)與討論

3.1 近紅外光譜具有全息性特點(diǎn)，可反映被測(cè)對(duì)象的物理、化學(xué)性質(zhì)甚至生物學(xué)屬性［10］，而AOTF-NIR光譜儀的便攜性又增加了其現(xiàn)場(chǎng)快速分析的優(yōu)勢(shì)，本研究借助PCA分析法，從對(duì)川貝母群的識(shí)別、川貝母群內(nèi)不同基原品種的定性分析及商品“松貝”與偽品之間的鑒別三個(gè)角度進(jìn)行了初步探討研究，結(jié)果較理想，為實(shí)現(xiàn)川貝母現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)快速檢測(cè)方法的建立提供了借鑒。

3.2 由于貝母為多年生植物，種植方式多樣 (包括種子和鱗莖)，造成不同年限、不同種植方式、不同采收期鱗莖性狀有差異，所以若想將該技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際工作中，PCA分析模型的建立是關(guān)鍵，需要通過收集大批量的藥材，擴(kuò)大建模集的數(shù)量，得到更為準(zhǔn)確和完善的川貝母定性分析模型，從而擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

3.3 2005年版《中國(guó)藥典》收載川貝母共四種基原植物，分別為川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母。由于川貝母資源短缺，2010年版《中國(guó)藥典》新增了太白貝母與瓦布貝母作為川貝母的基原植物，從本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果來看，新增的兩個(gè)基原與原來的四個(gè)基原貝母藥材在PCA空間分布圖中能夠很好的聚為一類，屬于川貝母群，可見他們?cè)诶砘再|(zhì)方面極為相近，表現(xiàn)為較近的親緣關(guān)系，與文獻(xiàn)［11-13］研究結(jié)果一致，進(jìn)一步說明《中國(guó)藥典》新增二者為川貝母的基原是科學(xué)合理的。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:34.

［2］魏 龍．松貝及常見混淆品的鑒別［J］．中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，6(29):144-145.

［3］李 慶，陳 新，王 曙．川貝母復(fù)合群之間的分子生物學(xué)親緣關(guān)系探討［J］．華西藥學(xué)雜志，2010，25(2):140-143.

［4］王 寧，蔡紹松，武衛(wèi)紅，等．一種基于聲光可調(diào)-近紅外光譜技術(shù)的復(fù)方丹參片快速定性分析方法［J］．中國(guó)中藥雜志，2008，33(16):1964-1967.

［5］王 寧，陳 雷，武衛(wèi)紅．基于聲光可調(diào)濾光器-近紅外光譜技術(shù)對(duì)六味地黃丸快速鑒別分析方法的研究［J］．藥物分析雜志，2010，30(8):1467-1471.

［6］梁逸曾，龔 范，俞汝勤．化學(xué)計(jì)量學(xué)用于中醫(yī)藥研究［J］．化學(xué)進(jìn)展，1999，19(2):208-209.

［7］聶小忠．對(duì)歷版《中國(guó)藥典》所載川貝品種的探討［J］．中國(guó)藥房，2008，19(9):717-718.

［8］劉震東，王 曙，陳心啟．關(guān)于瓦布貝母分類等級(jí)研究［J］．云南植物研究，2009，31(2):145-427.

［9］張莉娜，張耀甲，孫紀(jì)周．甘肅貝母性狀變異式樣的分析及分類處理［J］．西北植物學(xué)報(bào)，2001，25(1):844-856.

［10］Siesler H W，Ozaki Y，Kawata S，et al．Near-infrared spectroscopy:principles，instruments and applications［M］．Weinheim:Wiley-VCH，2002.

［11］徐傳林，李會(huì)軍，李 萍，等．川貝母藥材分子鑒定方法研究［J］．中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(3):226-230.

［12］段寶忠，黃林芳，王麗芝，等．川貝母新資源太白貝母中生物堿類成分含量測(cè)定［J］．中國(guó)藥學(xué)雜志，2011，46(5):382-384.

［13］黃林芳，段寶忠，王麗芝，等．川貝母新資源太白貝母中水溶性成分的含量測(cè)定［J］．中國(guó)中藥雜志，2011，36(5):585-588.