PI3K－Akt－eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在丙泊酚減輕缺氧／復(fù)氧損傷致乳鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用1）

王建剛，田首元，凡浙錄

丙泊酚是常用靜脈麻醉藥，已廣泛用于心血管手術(shù)麻醉[1]。既往研究表明，丙泊酚能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[2]。但其機(jī)制尚有待進(jìn)一步明確。磷脂酰肌醇－3－激酶／絲氨酸－蘇氨酸激酶／內(nèi)皮型一氧化氮合酶（PI3K－Akt－eNOS）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活參與介導(dǎo)缺血預(yù)處理減輕心肌缺血再灌注損傷的的作用[3]。丙泊酚的心肌細(xì)胞保護(hù)機(jī)制是否與PI3K－AkteNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)尚有待研究。本研究擬評(píng)估PI3KAkt－eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在丙泊酚減輕缺氧／復(fù)氧致乳鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取出生1d～3dWistar乳鼠，雌雄不限（山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供），75%酒精浸泡后，無(wú)菌條件下取其心臟置于預(yù)先盛有D－Hanks液的無(wú)菌平皿內(nèi)，用含抗生素的D－Hanks灌沖洗兩遍。取心室肌剪碎至1mm3～2 mm3大小的組織塊，移入5 0mL離心管中，用適量預(yù)溫的0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA 37℃水浴震蕩分次消化，每次約8min，直至組織塊完全消化。收集除第一次以外的單細(xì)胞懸液，放入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，終止消化7目篩網(wǎng)過(guò)濾去除未消化的組織，在4℃時(shí)以1 000 r／min離心10min，棄上清，收集沉淀，加入培養(yǎng)液（80%DMEM、20% 胎牛血清、青霉素100U／mL、鏈霉素100U／mL和0.1mmol／L BrDU）混懸。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×106／L。接種到25mL培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱（含95%空氣＋5%CO2）中培養(yǎng)2h以純化心肌細(xì)胞（差速貼壁法）。接種到24孔培養(yǎng)板中，每24h觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)情況，并更換培養(yǎng)液。其中BrDU在細(xì)胞培養(yǎng)36h內(nèi)加入以抑制非心肌細(xì)胞增殖。接種3d～4d后，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)24h，使細(xì)胞周期同步化后行缺氧／復(fù)氧干預(yù)。

1.2 心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 取上述原代培養(yǎng)6d～8d的整孔搏動(dòng)的6組心肌細(xì)胞（每組10孔）。隨機(jī)分為4組，參照Koyama[4]制備缺氧／復(fù)氧模型，并分為4組。Ⅰ組（對(duì)照組）：持續(xù)通以95%O2、5%CO2、37℃溫育60min。Ⅱ組（單純純氧／復(fù)氧組）：持續(xù)通以95%N2、5%CO2、37℃溫育40min，再持續(xù)通以95%O2、5%CO2、37℃溫育20min。Ⅲ組（缺氧／復(fù)氧＋丙泊酚組）：持續(xù)通以95%N2、5%CO2、37℃溫育40min，再持續(xù)通以95%O2、5%CO2、37℃溫育20min；缺氧同時(shí)給予丙泊酚（批號(hào)：P023398，AstraZeneca公司，意大利）50 μmol／L。Ⅳ組（缺氧／復(fù)氧＋丙泊酚＋渥曼青霉素組）：步驟同Ⅲ組，在丙泊酚處理前10min給予100nmol／L渥曼青霉素（批號(hào)：S1952，碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.3.1 心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 采用TUNEL法（試劑盒購(gòu)自Promega公司，美國(guó)）測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡率。TUNEL陽(yáng)性反應(yīng)為核呈棕褐色或棕黃色顆粒，核呈TUNEL陽(yáng)性反應(yīng)且具備細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征者被判定為凋亡細(xì)胞。熒光顯微鏡下，對(duì)同一片取5個(gè)不同視野，計(jì)算凋亡率（每一片數(shù)100個(gè)細(xì)胞核中凋亡核所占的百分比）的平均值。

1.3.2 Akt、p－Akt和eNOS、p－eNOS的 Western blot檢測(cè) 取培養(yǎng)6d～8d的6組乳鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行蛋白提純，采用Bradford方法測(cè)定蛋白濃度。免疫印跡時(shí)加等量上樣緩沖液，并煮沸5min，然后10%分離膠／5%積層膠上進(jìn)行電泳，應(yīng)用電轉(zhuǎn)儀（Bio－Rad，美國(guó)）將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。TBST洗滌，5min×3，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，然后用兔抗鼠Akt、磷酸化－Akt（p－Akt）、兔抗鼠eNOS、磷酸化－eNOS（p－eNOS）多克隆抗體（稀釋度1∶1 000，Cell Signal公司，美國(guó)）及兔抗鼠GADPH（稀釋度1∶1 000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，美國(guó)）4℃孵育過(guò)夜。次日用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗 （稀釋度1∶2 000，Cell Signal公司，美國(guó)）室溫孵育1h，ECL顯影。采用凝膠成像系統(tǒng)（UVP公司，美國(guó)）進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值與GADPH條帶灰度值的比值反映Akt、p－Akt、eNOS和p－eNOS蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌細(xì)胞凋亡率的比較 與Ⅰ組比較，其余各組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組心肌細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），Ⅳ組心肌細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Ⅲ組比較，Ⅳ組心肌細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.2 各組間心肌細(xì)胞 Akt、p－Akt和eNOS、p－eNOS蛋白表達(dá)水平的比較 各組間心肌細(xì)胞Akt和eNOS蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Ⅰ組比較，其余各組心肌細(xì)胞p－Akt和p－eNOS蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組心肌細(xì)胞p－Akt和p－eNOS蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），Ⅳ組心肌細(xì)胞p－Akt和p－eNOS蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Ⅲ組比較，Ⅳ組心肌細(xì)胞p－Akt和p－eNOS蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率、Akt、p－Akt、eNOS和p－eNOS蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表1 各組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率、Akt、p－Akt、eNOS和p－eNOS蛋白表達(dá)水平比較（±s）

組別 n 凋亡率（%） Akt p－Akt eNOS p－eNOSⅠ組10 6.5±0.2 100±23 20.1±5.2 94±13 15.3±3.3Ⅱ組 10 42.3±1.81） 105±20 37.2±6.51） 96±13 30.2±4.51）Ⅲ組 10 21.6±2.51）2） 110±25 68.2±5.81）2） 97±15 51.2±6.21）2）Ⅳ組 10 40.2±2.01）3） 108±21 40.3±6.11）3） 94±15 32.3±5.71）3）與Ⅰ組比較，1）P＜0.05；與Ⅱ組比較，2）P＜0.05；與Ⅲ組比較，3）P＜0.05

3 討 論

本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組比較，Ⅱ組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示乳鼠離體心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷模型制備成功。而Ⅲ組在乳鼠心肌細(xì)胞缺氧的同時(shí)加入50μmol／L丙泊酚后，結(jié)果顯示丙泊酚可減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷；本研究還提示丙泊酚可上調(diào)缺氧心肌細(xì)胞p－Akt和p－eNOS蛋白的表達(dá)，在給予PI3K特異性抑制劑渥曼青霉素后，p－Akt和p－eNOS表達(dá)下調(diào)，心肌細(xì)胞凋亡率升高，丙泊酚心肌細(xì)胞保護(hù)作用消失，提示PI3K－Akt－eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了丙泊酚減輕心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷的作用。

細(xì)胞凋亡機(jī)制主要有兩種，一種是通過(guò)激活caspase－8和caspase－3死亡通路，一種是線粒體信號(hào)通路[5]。既往研究已證 實(shí)，丙泊酚可以通過(guò)下調(diào)caspase－3、caspase－8以及上調(diào)Bcl－2表達(dá)發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用[6－8]；丙泊酚也可以通過(guò)抑制線粒體膜電位和膜通透性轉(zhuǎn)換，減少細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體的釋放而發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用[9－11]。

而細(xì)胞凋亡的這兩種通路都被認(rèn)為是PI3K－Akt通路的下游通路，受PI3K－Akt通路的調(diào)控[12，13]。PI3K超家族在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Akt是PI3K激活后的下游效應(yīng)器。Akt磷酸化后被激活，激活的Akt可磷酸化eNOS第1177位絲氨酸，使eNOS激活。eNOS是合成NO的限速酶，NO可激活蛋白激酶C和線粒體ATP敏感性鉀離子通道，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，降低線粒體膜通透性，抑制線粒體內(nèi)鈣超載，改善線粒體功能，抑制線粒體釋放凋亡因子而調(diào) 控細(xì) 胞 凋 亡 過(guò) 程[14，15]。PI3K－Akt通 路 也 可 通 過(guò) 調(diào) 控caspase－3、caspase－8以及Bcl－2家族參與抗心肌細(xì)胞凋亡的心肌保護(hù)作用。那么PI3K－Akt－eNOS通路是否參與了丙泊酚的上述抗心肌細(xì)胞凋亡作用尚待研究。

本研究 Western blot結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷后，心肌細(xì)胞p－Akt和p－eNOS蛋白表達(dá)上調(diào)，而給予丙泊酚后p－Akt和p－eNOS蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，然而這一效應(yīng)可被PI3K特異性抑制劑渥曼青霉素消除，提示PI3K－Akt－eNOS通路可能參與了丙泊酚的抗心肌細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，PI3K－Akt－eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了丙泊酚減輕缺氧／復(fù)氧致乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用。

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