氟西汀在實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎小鼠急性期的作用研究

王倩倩，張美妮

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）慢性自身免疫性炎癥性疾病，主要的病理特點為髓鞘脫失、炎性細胞浸潤和軸索損害。Tau蛋白屬于微管相關蛋白，主要存在于軸索上，在體外一般認為是促進微管裝配的因素[1]。Tau蛋白的生理學作用是穩(wěn)定微管和維持神經(jīng)元形狀和極性[2]。氟西汀是選擇性－5羥色胺（5－HT）再攝取抑制劑，廣泛應用于抑郁癥治療，有研究表明氟西汀具有免疫調(diào)節(jié)作用[3]。本研究擬建立實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）小鼠模型，探討氟西汀對EAE小鼠急性期的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗分組 將18g～20g，8周～10周，C57BL／6雌性小鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司）60只隨機分為氟西汀組、EAE組和對照組，每組各20只。

1.2 EAE模型制備 0.01mol／L的PBS將 MOG35－55（武漢博士德公司）稀釋，然后將稀釋液與等量含結核分枝桿菌的完全弗氏佐劑（武漢博士德公司）混合，用玻璃注射器抽吸成油包水狀，制成誘導EAE的抗原乳劑。氟西汀組和EAE組小鼠背部中央偏頭側皮下注射抗原乳劑。利用生理鹽水代替MOG35－55稀釋液，參照上述方法制備乳劑，供對照組使用。各組于免疫后第0天、第2天分別腹腔注射百日咳毒素（美國Sigma公司），每只600ng作為免疫增強劑。

1.3 給藥方法 氟西汀組于免疫前14d到免疫前1d每日胃管灌入氟西?。ò賾n解，生產(chǎn)由Patheon France，分包裝由禮來蘇州制藥有限公司）10mg／kg，EAE組和對照組于免疫前14d到免疫前1d每日胃管給予等量生理鹽水。

1.4 觀察實驗指標 從免疫當日起，采用雙人雙盲的方式隔天觀察和評定小鼠臨床癥狀的嚴重程度及體重變化（評分標準采用國際通用的5分制評分法）。免疫25d后，10%水合氯醛按0.1mL／20mg腹腔注射麻醉后，小鼠左心取血，左心室灌注磷酸鹽緩沖液至肝臟變白，再使用4%多聚甲醛至尾部僵直，解剖取大腦。用ELISA方法檢測血清Tau蛋白。用HE染色觀察炎癥及軸索損害情況。

2 結 果

2.1 小鼠臨床癥狀評分 EAE組小鼠于免疫10d后開始陸續(xù)發(fā)病，免疫后13d～20d達到發(fā)病高峰期，發(fā)病率為80%。發(fā)病時表現(xiàn)為皮毛不光滑、食欲下降、體重減輕、活動量減少；同時相繼出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀，先是表現(xiàn)為尾部肌張力低下，身體向一側傾倒，進一步進展為雙側后肢無力，不能翻身或翻身力弱，靠前肢爬行，無因病情危重而死亡。20只中4只未發(fā)病。免疫25d后取樣，除未發(fā)病4只的所有小鼠。氟西汀組小鼠于免疫13d后開始陸續(xù)發(fā)病，免疫后13d～20d達到發(fā)病高峰期，發(fā)病率為80%。癥狀與EAE組相比較輕，20只中有4只未發(fā)病，與EAE組相比，氟西汀組在神經(jīng)功能評分有統(tǒng)計學差異。對照組小鼠一直沒出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，體重持續(xù)上升，與EAE組相比，神經(jīng)功能評分差異有統(tǒng)計學意義。詳見表1。

表1 各組神經(jīng)功能評分比較（±s） 分

表1 各組神經(jīng)功能評分比較（±s） 分

組別 n 神經(jīng)功能評分EAE組 16 2.533±0.698氟西汀組 16 1.270±0.3761）對照組 20 01）與EAE組相比，1）P＜0.01

2.2 血清中Tau蛋白表達（見表2）

表2 各組Tau蛋白比較（±s） pg／mL

表2 各組Tau蛋白比較（±s） pg／mL

組別 n Tau蛋白EAE組 16 80.710±4.217氟西汀組 16 58.260±5.3661）對照組 20 19.950±2.8032）與EAE組相比，1）P＜0.01，2）P＜0.001

2.3 組織病理變化 HE染色發(fā)現(xiàn)EAE組小鼠大腦炎性浸潤呈典型的“袖套樣”改變，浸潤細胞以淋巴細胞和中性粒細胞為主，并且炎性浸潤部位及程度與臨床癥狀密切相關。氟西汀組小鼠大腦實質(zhì)中炎性細胞浸潤明顯減少。對照組小鼠大腦未見明顯異常改變。

3 討 論

本研究表明氟西汀能促進急性期EAE小鼠神經(jīng)功能緩解。Mostert等[4]的研究表明MS患者使用氟西汀之后，使 MRI增強病灶數(shù)目減少。本研究中，組織學表明EAE組小鼠大腦炎性細胞浸潤增多，氟西汀組小鼠大腦炎性細胞浸潤較EAE組減少。氟西汀的抗炎作用并未完全明確，但是研究表明氟西汀可能通過5－HT的調(diào)節(jié)來發(fā)揮作用。O’Connell等[5]認為氟西汀抑制樹突細胞從細胞外環(huán)境攝取5－HT和活化T細胞（合成5－HT）?？赡軐е聹p少環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的產(chǎn)生和促進初始T細胞的活化和分化[6]，這可能是治療 MS的一個機制。氟西汀提高星形膠質(zhì)細胞內(nèi)cAMP信號傳導，下調(diào)了Ⅱ類反式激活蛋白，從而抑制了促炎因子MCH－Ⅱ[6，7]。這個機制可以抑制具有免疫活性的CNS抗原提呈細胞所介導的免疫反應。病灶內(nèi)軸索損傷與病灶內(nèi)炎癥程度相關，表明炎癥是軸索損傷和脫髓鞘的病因。干擾素－γ（INF－γ）是導致髓鞘損傷和修復免疫介導的脫髓鞘病變的主要促炎性細胞因子[8]。MS患者和EAE小鼠的CNS中發(fā)現(xiàn)有高濃度的INF－γ蛋白和mRNA，并且和疾病的嚴重程度相關[9]。使用抗IFN－γ抗體治療EAE小鼠能減少EAE的發(fā)病率。氟西汀能減少促炎性因子INF－γ、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的釋放，增加抗炎因子白介素－10（IL－10）的釋放[10]。氟西汀通過減少INF－γ，抑制炎癥反應，減輕軸索損傷、脫髓鞘以及減少病灶。因此IFN－γ表達的調(diào)節(jié)可能是氟西汀治療EAE的機制之一。氟西汀作為MS的候選藥的原因還包括：星形膠質(zhì)細胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子的產(chǎn)生，比如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，刺激星形膠質(zhì)細胞糖原分解和鈉離子通道的阻礙[11－13]。鈉離子通道活化和星形膠質(zhì)細胞內(nèi)糖原分解受損導致減少軸索能量代謝被認為在MS患者軸損害中起了很重要的作用[14]。MS患者中，氟西汀提高腦白質(zhì)N－乙酰門冬氨酸／肌酸的比例，而N－乙酰門冬氨酸／肌酸被認為是軸索能量代謝的一種指標。Tau蛋白被認為是軸索損害、疾病進展和不可逆神經(jīng)功能缺損的生物學標記。本實驗研究表明氟西汀干預組和對照組相比，血液中Tau蛋白濃度顯著減少，神經(jīng)功能評分差異顯著，認為氟西汀促進EAE小鼠神經(jīng)功能的緩解。

總之，氟西汀能促進急性EAE神經(jīng)功能緩解和抑制CNS脫髓鞘，表明其有神經(jīng)保護作用。

[1]Weingarten MD，Lockwood AH，Hwo S－Y，etal.A protein factor essential for microtubule assembly[J].Proc Natl Acad Sci USA，1975，72：1858－1862.

[2]Kosik KS，F(xiàn)inch EA.MAP2and tau segregate into dendriticand axonal domains after the elaboration of morphologicallydistinct neurites：An immunocytochemical study of cultured rat cerebrum[J].J Neurosci，1987，7：3142－3153.

[3]Garrison GD，Levin GM.Factors affecting prescribing of the newer antidepressants[J].Ann Pharmacother，2000，34：10－14.

[4]Mostert JP，Admiraal－Behloul F，Hoogduin JM，etal.Effects of fluoxetine on disease activity in relapsing multiple sclerosis：A double－blind，placebo－controlled，exploratorystudy[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry，2008，79：1027－1031.

[5]O’Connell PJ，Wang X，Leon－Ponte M，etal.A novel form of immune signaling revealed by transmission of the inflammatory mediator serotonin between dendritic cells and T cells[J].Blood，2006，107：1010－1017.

[6]Li G，Harton JA，Zhu X，etal.Downregulation of CIITA function by protein kinase a（PKA）－mediated phosphorylation：Mechanism of prostaglandin E，cyclic AMP，and PKA inhibition of classⅡ major histocompatibility complex expression in monocytic lines[J].Mol Cell Biol，2001，21：4626－4635.

[7]Dong Y，Rohn WM，Benveniste EN.IFN－gamma regulation of the typeⅣclassⅡtransactivator promoter in astrocytes[J].J Immunol，1999，162：4731－4739.

[8]Wei ZS，Hong MF，Su QX，etal.Super－h(huán)igh－dose methylprednisolone does not improve efficacy or induce glucocorticoid resistance in experimental allergic encephalomyelitis[J].Neuroimmunomodulation，2011，18：28－36.

[9]Owens T，Wekerle H，Antel J.Genetic models for CNS inflammation[J].Nat Med，2001，7：161－166.

[10]Kenis G，Maes M.Effects of antidepressants on the production of cytokines[J].Int J Neuropsychopharmacol，2002，5：401－412.

[11]Mercier G，Lennon AM，Renouf B，etal.MAP kinase activation by fluoxetine and its relation to gene expression in cultured rat astrocytes[J].J Mol Neurosci，2004，24：207－216.

[12]Kong EK，Peng L，Chen Y，etal.Up－regulation of 5－HT2Breceptor density and receptor－mediated glycogenolysis in mouse astrocytes by long－term fluoxetine administration[J].Neurochem Res，2002，27：113－120.

[13]Pancrazio JJ，Kamatchi GL，Roscoe AK，etal.Inhibition of neuronal Na＋channels by antidepressant drugs[J].J Pharmacol Exp Ther，1998，284：208－214.

[14]Bechtold DA，Kapoor R，Smith KJ.Axonal protection using flecainide in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Ann Neurol，2004，55：607－616.