根癌農桿菌介導甘蔗遺傳轉化Bt（cry1Ab）基因

李曉梅 王閔霞 秦廷豪 陽翠 安琪 張軍

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是重要的糖能經濟作物，在世界各地廣泛栽植，其產糖量約占世界糖產量的60％- 70％［1］，在我國則占到90％以上［2］。甘蔗大田生產的整個生長發(fā)育期內均會受到多種蟲害威脅，尤以鱗翅目害蟲——蔗螟（主要有條螟、二點螟、大螟、白螟及黃螟等）危害最大，以幼蟲蛀入甘蔗幼苗和蔗莖，導致甘蔗商品性、糖分等品質下降，并帶來每年20％-25％的損失［3］。利用有性雜交技術培育抗蟲甘蔗品種是提高甘蔗抗蟲能力的重要途徑［4］。但是，甘蔗是高度雜合的異源多倍體和多倍的非整倍體植物，遺傳背景復雜，利用傳統(tǒng)育種方法從有性雜交到良種育成要10-13年，周期長，成效低［5，6］?；蚬こ炭梢远ㄏ蚋淖冏魑锏哪承┬誀睿瑸橹参镉N開辟了新途徑。

Arencibia等、Enriquez-Obreqon等和Elliott等［7-9］于1998年分別通過根癌農桿菌介導法成功地實現(xiàn)了甘蔗的遺傳轉化，開辟了甘蔗農桿菌介導法轉基因研究的先河。農桿菌介導法簡便、易于操作，克服了基因槍法及電擊法等直接轉化法轉化效率低，轉化體嵌合體多、轉化外植體不易成活及拷貝數(shù)多的缺點，所以研究甘蔗根癌農桿菌介導遺傳轉化對甘蔗遺傳工程改良有理論及實踐意義。

Bt基因是從微生物蘇云金桿菌分離出的一種殺蟲結晶蛋白基因，是一種廣譜性的抗蟲基因，它指導合成的殺蟲結晶蛋白（ICP）對許多鱗翅目、雙翅目及鞘翅目的昆蟲均有較強毒性。至1987年首次獲得轉Bt煙草植株以來，現(xiàn)已在許多植物的遺傳轉化中得以運用［10］。本研究旨在利用根癌農桿菌介導法將Bt（cry1Ab）基因導入自育甘蔗品種“川蔗23號”中，實現(xiàn)其抗蟲性改良。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗材料為“川蔗23號”，由四川省植物工程研究院糖料作物研究所選育，于2011年11月至2012年2月取自研究院內試驗場，每次取10個蔗鞘。

1.1.2 菌株與質粒 根癌農桿菌菌株EHA105由四川省農業(yè)科學院生物與核技術研究所提供，具有卡那霉素及利福平抗性。質粒為pCAMBIA1301-Cry1Ab，攜帶潮霉素磷酸轉移酶基因（Hpt），以玉米的Ubi-1為啟動子。

1.1.3 試劑 卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、羧芐青霉素（Car）、乙酰丁香酮（AS）和潮霉素（Hyg）均為Sigma公司產品，Taq DNA聚合酶、dNTP為上海生工產品，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及其它試劑為國產分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基 甘蔗植株再生及遺傳轉化各個階段的最佳培養(yǎng)基，見表1。

表1 甘蔗再生體系建立及遺傳轉化培養(yǎng)基的組成

1.2 方法

1.2.1 胚性愈傷的誘導及再生體系的建立 以川蔗23號的幼嫩葉鞘為外植體，經常規(guī)滅菌后切成厚度為0.3cm左右的幼葉卷，接種于M1上，25℃黑暗培養(yǎng)，誘導胚性愈傷組織。胚性愈傷轉入M2上，25℃，1500lx下分化培養(yǎng)，當分化苗約5cm時將其轉入M3中生根培養(yǎng)，20d后進行煉苗假植，移栽至含有蛭石∶草炭=1∶1的盆缽內，成活后移栽入大田。

1.2.2 潮霉素抗性濃度的篩選試驗 將胚性愈傷組織和叢芽分別轉入添加不同濃度Hyg（0、10、20、30、40和50mg/L）的M1、M2、M3上，觀察愈傷生長、叢芽分化及生根情況，確定甘蔗不同分化階段最佳潮霉素篩選濃度。

1.2.3 農桿菌工程菌液的制備 從M4上挑取單菌落于新鮮的M4上劃線培養(yǎng)，48-72h后刮取長0.5-1.0cm的菌體，懸浮于M5內，其OD600為0.1左右［11］，再置于28℃，180r/min條件下振蕩培養(yǎng)2h，以誘導農桿菌vir基因的活化表達，此菌液即為轉化工程菌液。

1.2.4 胚性愈傷的預培養(yǎng)及預處理 胚性愈傷組織置于培養(yǎng)基M1上預培養(yǎng)4d，轉化前于超凈工作臺吹風處理45min左右，讓其微微干縮，以待用。

1.2.5 甘蔗的遺傳轉化 將預處理的胚性愈傷浸沒于工程菌液中感染1.5min［11］，轉到濾紙上吸干多余菌液，然后接種到M6上，23℃黑暗共培養(yǎng)3-4d。用無菌水清洗至無渾濁后，用含有Car 500mg/L的無菌水浸泡2min，再用無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干后，接種于M7上，25℃黑暗培養(yǎng)14d，轉入M8中25℃，1500 lx光照強度下培養(yǎng)以誘導芽的形成，當抗性芽長至5cm左右時，轉入M9中以篩選抗性完整植株。為篩選適宜于甘蔗遺傳轉化的愈傷年齡，分別用接種后20、30、40和50d的愈傷為受體，每個處理20個外植體，重復3次，經 20mg/L潮霉素抗性篩選20d后，以抗性愈傷百分率的高低評判胚性愈傷的優(yōu)劣。

抗性愈傷率（％）=抗性愈傷組織塊數(shù)/接入愈傷組織塊數(shù)×100％

1.2.6 抗性植株的PCR檢測 采用改良CTAB法提取植株葉片的總DNA，根據(jù)Bt（Cry1Ab）中間序列合成反應引物5' -TCATCCAGCGAATCTACC-3'和5'-AACAGTGCCCTTACAACC-3'，目的片段大小為823bp（由上海生工合成）。分別以潮霉素抗性植株的DNA、對照甘蔗植株的DNA及質粒DNA為模板，用合成引物，在49℃退火溫度下進行PCR擴增檢測。

2 結果

2.1 甘蔗胚性愈傷的誘導及不定芽的再生

切取的幼葉卷在M1上培養(yǎng)大約3-5d 后開始膨大，并從葉卷中心開始凸起，愈傷組織最開始從葉卷內部及葉卷邊緣開始形成（圖1-A）。培養(yǎng)25d后外植體整個形成疏松、黃色、水分含量較多的愈傷組織，并在其上有零星團狀白色、致密、顆粒狀的愈傷形成，此類愈傷組織即為胚性愈傷組織。它們除了具有分生能力強、易于再生等特性外，還有與胚細胞相似的接受T-DNA的能力。為使侵染材料胚性一致，將誘導的少量胚性愈傷進行繼代培養(yǎng)，2周后即可作為浸染材料（圖1-B）。胚性愈傷組織分化能力極強，在轉入分化培養(yǎng)基后7d左右就有綠色芽點形成，約2周后即長至2cm長，由于胚狀體是由單細胞發(fā)育而來，因此胚性愈傷團發(fā)育形成芽叢，不定芽轉入生根培養(yǎng)基后都能達到100％的生根率，并且在主芽周圍還能分蘗形成許多側芽（圖1-C）。

在研究中發(fā)現(xiàn)甘蔗外植體極易褐化，在切取外植體的過程中其傷口隨即變?yōu)楹稚?，在培養(yǎng)過程中約有15％的外植體不能產生愈傷組織而褐化、死亡，有些外植體在形成愈傷組織后也極易褐化。研究發(fā)現(xiàn)通過添加50mg/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可有效減輕愈傷組織在培養(yǎng)過程中的褐化（圖2），但對不能形成愈傷組織的外植體無效。

圖1 甘蔗再生體系的建立

圖2 添加50mg/LPVP對愈傷褐化的抑制作用

2.2 潮霉素濃度對胚性愈傷增殖、分化及叢芽生根的影響

潮霉素抗性濃度篩選預試驗表明，隨著潮霉素濃度的增加胚性愈傷增殖率、分化率及生根率都逐漸下降（表2）。當潮霉素濃達20mg/L時甘蔗胚性愈傷分化率僅為11％，并且分化的不定芽不能伸長，約10d后黃化死亡（圖3-A）。由于未轉化細胞的死亡會影響周圍轉化細胞的生長，為保證轉化細胞的生長，在前期篩選階段選擇較低濃度的潮霉素（20mg/L）。甘蔗小芽對潮霉素的耐受性稍大于胚性愈傷，在10mg/L濃度下其生根率達到100％，只是再生的根與對照相比較少、較纖弱并且顏色為褐色（圖3-B），在20mg/L濃度下其生根率為38.9％，形成的根較短色澤較深，上部芽部分黃化，約40d后植株整體死亡。在30mg/L時，其芽叢不能生根，并且20d后全部褐化死亡。為防止假陽性植株的逃逸，其生根篩選壓以30mg/L為宜。

表2 潮霉素濃度對愈傷組織增殖、分化及不定芽生根的影響

圖3 潮霉素對胚性愈傷再生及不定芽生根的篩選作用

2.3 甘蔗的遺傳轉化及抗性植株的獲得

2.3.1 轉化用適齡愈傷組織篩選 受體材料的生理狀況及胚性的一致性是轉化成功的關鍵。以外植體接種后20、30、40和50d的愈傷組織作為起始材料進行轉化試驗，經20mg/L潮霉素連續(xù)篩選20d后統(tǒng)計結果（表3）表明，當愈傷齡期在40d以前，抗性愈傷率隨著齡期增加而增加，超過40d則顯著降低，因此培養(yǎng)40d的愈傷組織為轉化受體適齡愈傷組織。

表3 不同齡期愈傷組織經20mg/L潮霉素篩選后抗性愈傷率

2.3.2 抗性植株的獲得 以培養(yǎng)40d胚性一致，大小為0.3-0.5cm的愈傷組織塊為受體材料，用OD600值為0.1左右的工程菌液浸染1.5min，經抗性愈傷篩選后的胚性愈傷在分化篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)40d左右即可分化出小苗（圖4-A）。本研究共進行了4批次的重復試驗，侵染愈傷組織764塊，最終獲得98塊抗性愈傷，轉入M8后40d分化出31個抗性植株（系），將抗性株系分株轉入M9中，共有65個單株生根，經PCR檢測后有2株擴增到目的條帶（圖4-B），擴增到目的條帶的兩株植株相對于其他植株生長較弱，只有12個分蘗（圖4-C），但陽性植株轉入大田栽培后，其長勢與分蘗能力與對照無差異（圖4-D），陽性植株等待進一步的Dot-Southern檢測及田間抗蟲性驗證。

圖4 甘蔗的遺傳轉化與檢測

3 討論

外植體褐變是植物組織培養(yǎng)的三大技術難點之一，也是甘蔗組織培養(yǎng)的主要技術難點。在甘蔗中含有較多的酚類物質，這些物質極易氧化成褐色的醌類物質，醌類物質在酪氨酶等的作用下，使外植體細胞中的蛋白質聚合，生長停頓，最終導致死亡。在不同生長季節(jié)，甘蔗植株體內酚類化合物含量和多酚氧化酶的活性不相同。一般在夏、冬季節(jié)酚類物質含量和多酚氧化酶活性有所提高，此時外植體的褐化率較高［12］。本試驗研究發(fā)現(xiàn)“川蔗23號”甘蔗幼葉卷外植體褐化率高達15％左右，這些外植體未膨大，仍保持接種時的狀態(tài)即完全褐化，在形成愈傷后其愈傷褐化率逐漸降低，可能是因為取材時間在冬季的原因。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是酚類物質的專一性吸附劑，可用于防止褐變。本研究發(fā)現(xiàn)添加50mg/L PVP可有效降低培養(yǎng)中愈傷組織的褐化率，但對于未形成愈傷即褐變的外植體效果不明顯。

潮霉素是根癌農桿菌介導植物遺傳轉化研究中應用較多的抗生素之一。本研究發(fā)現(xiàn)甘蔗在愈傷組織分化與再生苗生根階段對潮霉素較敏感，其最佳篩選濃度分別為20mg/L、30mg/L，這與陳麗新等［13］的研究結果相似。

選用適宜的受體材料是轉化成功的關鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)25d后的外植體上形成的愈傷主要為非胚性愈傷，其上只有零星的胚性愈傷顆粒，40d齡期的愈傷組織胚性較一致且大小適宜，經潮霉素篩選后抗性愈傷率較高；當愈傷齡期超過40d后，愈傷組織容易褐化并產生黏性物質，并且有部分愈傷即使在黑暗培養(yǎng)條件下也會開始逐漸分化，不利受體的遺傳轉化。而羅敬萍等［14］研究表明培養(yǎng)25d的甘蔗愈傷組織胚性較好，為最適轉化受體。這可能與甘蔗品種及取材時間有關，不同品種及取材時間其外植體活性不同，達到一致胚性狀態(tài)的時間不同。

在根癌農桿菌介導植物遺傳轉化中工程菌液的濃度與侵染時間是影響轉化率的重要因素。在預試驗階段采用王自章等、唐建平等［15，16］遺傳轉化甘蔗中使用的農桿菌菌液濃度與侵染時間進行“川蔗23號”的遺傳轉化，但均因在篩選培養(yǎng)階段農桿菌的過度增殖導致胚性愈傷缺氧而褐化、死亡，未能獲得抗性植株。日本研究者Nishimura等［11］在水稻農桿菌遺傳轉化中的研究發(fā)現(xiàn)較低的農桿菌侵染濃度與較短的侵染時間也可高效的遺傳轉化水稻。因此，在后續(xù)的試驗中采用Nishimura等用于水稻遺傳轉化的方法進行甘蔗的遺傳轉化研究。結果發(fā)現(xiàn)，用較低的根癌農桿菌侵染濃度與較短的侵染時間處理后的甘蔗胚性愈傷在共培養(yǎng)3d后也會有可見的菌體出現(xiàn)，在脫菌中用含有500mg/L Car的無菌水中浸泡2min再轉入篩選培養(yǎng)基中即可很好的抑制農桿菌的生長。

至1987年Chen等［17］首次開展甘蔗轉基因以來，國內外許多學者成功應用基因槍法、電擊法及根癌農桿菌介導法將多種外緣基因（如抗病性基因SCMV-CP、抗蟲基因Bt、抗除草劑基因Bar、開花啟動基因Leafy、抗旱基因Tsase等）轉入甘蔗中［18，19］。但相對于水稻、小麥、玉米等單子葉植物來說，甘蔗轉基因技術相對滯后，開展或利用有效的轉基因方法，如利用雙元或多元載體系統(tǒng)，建立高效表達的受體系統(tǒng)，構建適合甘蔗的特異啟動子，加強農桿菌介導法的研究及功能基因的分離將是今后甘蔗轉基因研究的重點。

4 結論

本研究以“川蔗23號”幼嫩葉鞘為外植體，以超毒菌株EHA105為轉化的農桿菌菌株，Hpt基因為篩選標記，Ubi為啟動子，以40d胚性愈傷為受體材料，首次在甘蔗上采用低濃度的農桿菌（OD600=0.1左右）和較短的侵染時間（1.5min），成功實現(xiàn)了甘蔗的遺傳轉化Bt（cry1Ab）基因。

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