體腔積液薄層液基細(xì)胞涂片免疫組化染色方法研究

王興波 王 靜 馮冬青 萬(wàn)曉書(shū) 王東梅

1.河北省秦皇島市第二醫(yī)院，河北秦皇島 066000；2.河北省秦皇島市昌黎縣婦幼保健院，河北昌黎 066600；3.河北省秦皇島市婦幼保健院，河北秦皇島 066000

薄層液基細(xì)胞技術(shù)（thin-layer cytology test，TCT）是20世紀(jì)90年代興起的一項(xiàng)新技術(shù)，最早應(yīng)用于婦科宮頸細(xì)胞學(xué)檢查，并獲得了良好的效果[1]。隨后人們不斷將此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用到非婦科細(xì)胞學(xué)檢查[2-4]，并與傳統(tǒng)脫落細(xì)胞學(xué)涂片比較，具有薄層、背景清晰、面積小、血液成分少、利于顯微鏡觀察等優(yōu)點(diǎn)，但在癌性體腔積液TCT檢查中存在癌細(xì)胞比較散在或細(xì)胞團(tuán)不如傳統(tǒng)涂片立體感強(qiáng)等不足。經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色癌細(xì)胞與間皮細(xì)胞的鑒別有時(shí)很困難，對(duì)癌細(xì)胞來(lái)源及分類更一籌莫展。體腔積液多數(shù)混有間皮細(xì)胞，常常需要免疫組化（immunohistochemistry，IHC）染色與癌細(xì)胞加于鑒別，并對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行分類。IHC染色如果不先經(jīng)HE染色，則不清楚TCT涂片中是否存在癌細(xì)胞或可疑癌細(xì)胞（目標(biāo)細(xì)胞）或者TCT涂片是否合格，如果經(jīng)HE染色而采取不同退色方法，會(huì)造成不同結(jié)果。有報(bào)道使用鹽酸、高錳酸鉀及草酸等對(duì)傳統(tǒng)涂片和組織切片HE染色進(jìn)行退色[5-6]。筆者曾在組織切片上采用抗原熱修復(fù)方法退色，效果較好[7]。胸水TCT涂片IHC染色，由于每張TCT涂片中的細(xì)胞排列是隨機(jī)的，常規(guī)IHC染色針對(duì)性較差，往往造成診斷困難，為了準(zhǔn)確鑒別間皮細(xì)胞與癌細(xì)胞以及對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)分類從而達(dá)到確診目的，本小組采用雙重免疫組化（double immunohistochemistry，DIHC）染色，即在一張 TCT涂片上，同時(shí)顯示兩種抗原成分[8]，來(lái)彌補(bǔ)一些抗體敏感性雖高而特異性低的不足，收到良好效果，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

收集2009年3月～2012年3月秦皇島市第二醫(yī)院病理科肺癌伴胸水轉(zhuǎn)移送檢病例68例，年齡45～70歲，中位年齡63歲，64排CT均顯示肺內(nèi)占位病變，伴縱隔淋巴結(jié)腫大及胸腔積液。其中9例有鎖骨上窩淋巴結(jié)腫大、質(zhì)硬。經(jīng)氣管鏡、穿刺活檢或切取鎖骨上腫大淋巴結(jié)等手段，獲取組織學(xué)標(biāo)本，并及時(shí)經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟切片，經(jīng)HE染色和IHC染色確定診斷為：鱗狀細(xì)胞癌13例，腺癌40例，腺鱗癌6例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌9例；同時(shí)獲取新鮮胸水每例500mL，采用TCT制片。TCT制片設(shè)備為康柏液基細(xì)胞制片機(jī)及配套耗材，由湖南長(zhǎng)沙康柏恩醫(yī)療科技公司提供。免疫組化染色抗體選為：TTF-1，CK7，CK14，CK18，P63，P40，CgA，Syn，CR1 （檸檬酸修復(fù)），CR2（EDTA 修復(fù)），Vimentin，CEA和MC，常規(guī)IHC染色采用 ElivisionTMPlus，DIHC染色采用 Dou MaxVision，細(xì)胞通透劑為X-100，所選試劑均購(gòu)于福州邁新公司。

1.2 方法

1.2.1 制片

將每例活檢組織選一蠟塊進(jìn)行切片，厚約4 μm，分別切12張，裱于防脫載玻片上，60℃烤2 h，經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟，入水沖洗干凈。每個(gè)病例抽取新鮮胸腔積液500 mL，立即制片，分取 10 mL液體，放入一次性塑料試管，每例取36管，放入低速離心機(jī)，1500 r/min，離心10 min，吸取上清液放入潔凈試管中留作沖洗液，將沉渣逐一轉(zhuǎn)移到TCT保存液當(dāng)中，震蕩1 min，用制片機(jī)制片，肉眼見(jiàn)細(xì)胞層較厚時(shí)，用同例胸水離心上清液稍加沖洗，使細(xì)胞涂層變薄，立即風(fēng)干固定于95%乙醇液中15 min，取出在60℃烤箱烤15 min，每例制36張TCT涂片。

1.2.2 分組及染色

將每例胸腔積液36張TCT涂片隨機(jī)平均分成B、C、D三組，每組12張TCT涂片。

1.2.2.1 A組 為活檢石蠟切片，一抗選擇TTF-1、CK7、CK14、CK18、P63、P40、CgA、Syn、CR1（檸檬酸修復(fù)）、Vimentin、CEA和MC，設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照片，按ElivisionTMPlus操作方法完成免疫組化染色，DAB顯色。

1.2.2.2 B組 先經(jīng)HE染色，顯微鏡下選擇合格涂片：細(xì)胞排列均勻、基本單層、目標(biāo)細(xì)胞核-漿-膜結(jié)構(gòu)清晰。然后去掉蓋玻片，經(jīng)二甲苯脫膠，梯度乙醇（由高濃度至低濃度）脫二甲苯，最后入水清洗。再將B組分成B1、B2組：要求EDTA修復(fù)的為B1組，其余為B2組?，F(xiàn)配EDTA液（pH=9.0）按1∶50配置（一份原液和50份蒸餾水混合）適量，放入潔凈高壓鍋中，去蓋先加熱至沸騰，將B1組TCT涂片放入沸騰的EDTA中，加蓋繼續(xù)加熱至噴氣2 min，自然冷卻；再將配制好的檸檬酸液（pH=6.0±0.1），放入潔凈高壓鍋內(nèi)適量，開(kāi)蓋加熱至沸騰，放入B2組TCT涂片，加蓋繼續(xù)加熱至噴氣1 min，自然冷卻。安全取出抗原修復(fù)的涂片，用PBS沖洗。通過(guò)EDTA和檸檬酸高壓加熱修復(fù)，HE染色TCT涂片徹底退色。DIHC染色前滴加過(guò)氧化物酶阻斷劑，以防止由于抗原修復(fù)導(dǎo)致的內(nèi)源性生物素與抗體產(chǎn)生非特異性結(jié)合。在滴加一抗前，用X-100細(xì)胞通透劑進(jìn)行處理，增加細(xì)胞的通透性，有利于抗原抗體結(jié)合。DIHC染色是采用不同顏色的顯色劑，顯示不同抗原成分，顯色遵循先深后淺，胞膜、胞核著深色，胞質(zhì)著淺色，選擇好抗體搭配。本組一抗搭配：MC-Syn，MC-CgA，MC-P40，MC-CK181，MC-CK7 或MC-CK14，CR2-P40，CR1-TTF1，CR1-P63。 染色采用DouMaxVision方法，BCIP/NBT/AEC顯色，其步驟按照DIHC染色要求，設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照片。

1.2.2.3 C組 經(jīng)HE染色，顯微鏡選擇合格涂片，去掉蓋玻片，經(jīng)二甲苯脫膠，梯度乙醇（由高濃度至低濃度）脫二甲苯，最后入水清洗。用0.5%鹽酸及草酸溶液常溫退色10 min，入水沖洗。一抗選擇TTF-1、CK7、CK14、CK18、P40、CgA、Syn、CR1、Vimentin、CEA 和 MC，設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照片，在滴加一抗前，應(yīng)先用X-100細(xì)胞通透劑進(jìn)行處理，按IHC染色ElivisionTMPlus操作方法完成，DAB顯色。

1.2.2.4 D組 不經(jīng)HE染色直接做IHC染色，一抗選擇TTF-1、CK7、CK14、CK18、P40、CgA、Syn、CR、Vimentin、CEA和MC，設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照片，在滴加一抗前，應(yīng)先用X-100細(xì)胞通透劑進(jìn)行處理，按ElivisionTMPlus操作方法染色，DAB顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組化染色結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：著色部位正確，無(wú)背景著色，著色對(duì)比鮮明，即使有一個(gè)細(xì)胞著色也視為陽(yáng)性。B、C、D三組免疫組化染色結(jié)果與組織病理A組結(jié)果比較，B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。 見(jiàn)表1。

3 討論

近年來(lái)TCT檢查廣泛應(yīng)用于臨床，包括宮頸液基細(xì)胞檢查、體腔腔積液、氣管鏡刷片及灌洗液、腫瘤穿刺液、尿液及腦脊液等。對(duì)腫瘤的診斷、鑒別診斷及腫瘤分類起著重要的作用。肺癌伴胸水轉(zhuǎn)移的患者，一般失去手術(shù)機(jī)會(huì)，多采用化療和放療。但首先要明確是否伴胸水轉(zhuǎn)移以及腫瘤的詳細(xì)分類。如果能獲得活檢組織病理診斷為最佳，但取活檢受多方面因素影響，往往很困難，只有通過(guò)胸水檢查來(lái)明確診斷和分類。前言提到TCT檢查較傳統(tǒng)涂片有其優(yōu)缺點(diǎn)，不論TCT涂片還是傳統(tǒng)涂片，雖經(jīng)HE染色診斷，但常需要借助免疫組化染色才能與間皮細(xì)胞鑒別和明確腫瘤細(xì)胞來(lái)源及分類。每張TCT涂片中存在多種形態(tài)各異的細(xì)胞，包括反應(yīng)性增生的間皮細(xì)胞，有時(shí)形似癌細(xì)胞，免疫組化染色時(shí)間皮細(xì)胞不但表達(dá)CR和MC，還可表達(dá)某些角蛋白CK等多種抗原成分。在一張TCT涂片上只用一種抗原如CK（特異性低），不能區(qū)分間皮細(xì)胞和癌細(xì)胞。CR和MC敏感性雖高但特異性不高，文獻(xiàn)報(bào)道二者敏感性可達(dá)100%，Murugan等[9]報(bào)道38例反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生病例中CR敏感度為100%，特異度為92.31%。Betta等[10]認(rèn)為CR的敏感性為98%，陳穎等[11]的研究認(rèn)為CR的特異性為69.5%，趙維聰?shù)萚12]報(bào)道CR及MC敏感性為100%，特異性分別為82.1%和17.9%。普遍認(rèn)為CR和MC的敏感性高，而特異性相對(duì)較低且不一致。若一張TCT涂片上的不同細(xì)胞分別表達(dá)不同抗原或一個(gè)細(xì)胞不同部位同時(shí)表達(dá)兩種不同抗原，就可以大大增強(qiáng)抗原表達(dá)的特異性和敏感性，這就是免疫組化雙重染色與常規(guī)免疫組化染色的區(qū)別。郗彥鳳等[8]利用BSAP/CD30標(biāo)記經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤中的R-S細(xì)胞是石蠟切片，林秋霞等[12]用PCNA+NF-160的免疫雙標(biāo)記證明培養(yǎng)細(xì)胞中分裂神經(jīng)元是否為成熟神經(jīng)元是培養(yǎng)細(xì)胞，也有報(bào)道利用原位雜交和免疫組化進(jìn)行細(xì)胞雙標(biāo)記[13-14]，均取得了良好效果。但DIHC染色同時(shí)采用抗原熱修復(fù)退色技術(shù)在TCT中的應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)對(duì)TCT涂片免疫組化研究，發(fā)現(xiàn)HE染色檸檬酸或EDTA修復(fù)退色做雙重免疫組化染色效果最好、確診率高，而用鹽酸退色常規(guī)免疫組化染色次之，未經(jīng)HE染色的較差。分析其原因，前兩種方法，都使用了HE染色，顯微鏡觀察，選出了合格的TCT涂片，期中B組采用抗原熱修復(fù)方法退掉HE染色，既不損傷抗原成分，又無(wú)染料分子阻礙抗原抗體結(jié)合；C組經(jīng)HE染色后選用鹽酸和草酸退色，抗原成分遭到一定程度破壞[6]，造成部分假陰性，導(dǎo)致確診率下降；D組是未經(jīng)HE染色，顯微鏡下無(wú)法選擇合格涂片，存在不合格涂片，導(dǎo)致確診率降低。通過(guò)對(duì)68例有組織學(xué)對(duì)照的癌性胸水做TCT檢查，旨在探討液基細(xì)胞HE染色聯(lián)合DIHC染色對(duì)癌性胸水進(jìn)行診斷、鑒別診斷及分類診斷的價(jià)值，結(jié)果顯示抗原修復(fù)退色聯(lián)合DIHC染色為最佳方法，在體腔積液TCT診斷中起者重要的作用，尤其適用于數(shù)量很有限的TCT涂片，值得借鑒。

表1 68例肺癌伴胸水轉(zhuǎn)移組織學(xué)與液基細(xì)胞免疫組化染色診斷結(jié)果比較（例）

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