熒光定量PCR法檢測線粒體基因A1555G與C1494T突變

林文津 郭舜民 徐榕青 肖志勇 張亞敏

1.福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院 福建省醫(yī)學(xué)測試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350001；2.福建省福州市第二醫(yī)院，福建福州 350007

線粒體12SrRNA基因是氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致的非綜合征型聽力損失的一個突變熱點(diǎn)區(qū)域。由于A1555G和C1494T突變在12SrRNA基因形成G-C和U-A配對使得與氨基糖苷類抗生素的結(jié)合更加容易，這就是為何攜帶這些突變的人在接觸了氨基糖苷類抗生素時會出現(xiàn)或加重耳聾的原因[1]。因此，對這兩個點(diǎn)突變的檢測，對于預(yù)防氨基糖苷類抗生素中毒性耳聾有著重要的臨床意義。目前關(guān)于線粒體耳聾基因的檢測方法有多種，文獻(xiàn)已報(bào)道的方法有酶切法[2-3]、直接測序法[2-6]、基因芯片法[7-10]、實(shí)時熒光定量Taqman探針法[11]等。檢測的突變熱點(diǎn)主要是1555、1494、961等[12-13]。本次試驗(yàn)采用熒光定量PCR法檢測95例非綜合征藥源性耳聾患者及其家屬線粒體基因A1555G、C1494T突變，并采用傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳測序法進(jìn)行確證，現(xiàn)將檢測結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

95例非綜合征型耳聾患者及其家屬均為漢族，其中，男44例 女51例，聾病先證者54例（男39例，女15例）。經(jīng)知情同意后，首先對先證者及其家屬進(jìn)行病史調(diào)查，包括家族史、耳聾史及耳毒性藥物的使用情況等，同時進(jìn)行純音聽域測試，明確先證者均為非綜合征型耳聾。

1.2 儀器與試劑

PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司）；ABI 3130測序儀、ABI 7500熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems）。Taq酶、dNTP（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；測序引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；藥物性耳聾基因突變檢測試劑盒及陽性對照試劑（智海生物工程北京有限公司）。

1.3 全血基因組DNA提取

用枸櫞酸鈉抗凝的一次性采血管，取受檢者的外周靜脈血約2 mL，采用離心吸附柱法按照血液基因組DNA提取試劑盒的操作說明書操作，提取受檢者全血基因組DNA，用瓊脂糖凝膠（1%）電泳檢測。所提取的DNA條帶清晰，完整性好，紫外分光光度計(jì)檢測DNA 濃度約為 50 ng/μL。

1.4 熒光定量PCR檢測

取出試劑盒中擴(kuò)增反應(yīng)液，解凍后取18 μL，再加入2 μL提取得到的DNA或?qū)φ掌啡芤海靹?，然后上機(jī)進(jìn)行檢測。溫度循環(huán)程序分4個步驟：①37℃5 min，1 個循環(huán)；②95℃ 15 min，1 個循環(huán)；③95℃ 15 s，54℃ 20 s，72℃ 20 s，40 個循環(huán)；④95℃ 15 s，60℃1 min，95℃ 15s，60℃ 15 s，1 個循環(huán)，進(jìn)行熔解曲線分析。

1.5 mtDNA測序

1.5.1 PCR反應(yīng) PCR引物根據(jù)從 NCBI下載的人線粒體基因組序列，利用Gene Tools軟件自行設(shè)計(jì)，所設(shè)計(jì)引物的PCR產(chǎn)物為線粒體1262～1772位點(diǎn)，共計(jì)511 bp，能同時檢測1494與1555位點(diǎn)的突變。PCR反應(yīng)體系見表1。PCR程序：①94℃ 5 min，1個循環(huán)；②94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，32 個循環(huán)；③72℃ 10 min，1 個循環(huán)。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.5.2 測序 將PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)方法制備成測序模板后用傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法在ABI 3130測序儀上測序分析。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR檢測結(jié)果

除空白對照組外，各反應(yīng)管均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，各PCR產(chǎn)物的Tm值之間均能很好的進(jìn)行區(qū)分（大于2℃），1494T 標(biāo)準(zhǔn)對照管出現(xiàn) 78.2℃和 84.5℃的熔解峰，分別為1494T和質(zhì)控峰（圖1A）；1555G標(biāo)準(zhǔn)對照管主要出現(xiàn)74.9℃和84.1℃的熔解峰，分別為1555G和質(zhì)控峰（圖 1B）；1555G陽性患者出現(xiàn) 75.7℃和84.8℃的熔解峰，分別為 1555G 和質(zhì)控峰（圖 1C）；正常人僅出現(xiàn)1個84.2℃的熔解峰，為質(zhì)控峰（圖1D）；以無菌雙蒸水為模板的空白對照為一直線，未見熔解峰（圖1E）。綜合上述檢測結(jié)果，可以判定在75℃附近出現(xiàn)熔解峰，說明有A1555G突變，在78℃出現(xiàn)熔解峰，說明有C1494T突變，正常人僅在84℃附近出現(xiàn)熔解峰。

根據(jù)上述判定方法，本試驗(yàn)共發(fā)現(xiàn)4例A1555G突變患者，占先證者7.41%，占高危人群（先證者及其家屬）4.26%，未發(fā)現(xiàn)C1494T突變患者，見表2。采用PASWSTAT統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)交叉表McNemar檢驗(yàn)分析，P=1.000，說明兩種方法檢測效果相同。

圖1 熒光定量PCR法檢測的熔解曲線圖

表2 熒光定量PCR法與測序法檢測結(jié)果比較（例）

2.2 線粒體基因序列分析

運(yùn)用GeneTools軟件將測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站上公布的人線粒體基因標(biāo)準(zhǔn)序列比對，結(jié)果顯示僅這4例陽性患者線粒體基因發(fā)生了線粒體基因 A1555G突變。所有檢測結(jié)果均與所測標(biāo)本的真實(shí)結(jié)果一致，從而驗(yàn)證了本方法是準(zhǔn)確有效的。結(jié)果提示，線粒體基因A1555G突變可能是這4例患者非綜合征耳聾遺傳易感性的分子基礎(chǔ)。查閱患者病例資料發(fā)現(xiàn)，該4例A1555G陽性患者雙耳均出現(xiàn)了不同程度的聽力損傷，且均為女性，其中兩位為母女關(guān)系，這也從側(cè)面反映了藥源性耳聾這一線粒體病呈現(xiàn)出母系遺傳的特點(diǎn)。

3 討論

氨基糖苷類抗生素包括慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素等，因其對革蘭陰性菌的感染特別有效，同時對于某些革蘭陽性菌也有協(xié)同抗菌作用，在臨床上仍在廣泛使用。此外，疫苗是另一個潛在的危險(xiǎn)因素，大多數(shù)人并不知道疫苗中含有氨基糖苷類抗生素，如國家計(jì)劃免疫的麻疹疫苗中含有新霉素，水痘疫苗中含有新霉素，甲流疫苗中含有硫酸慶大霉素。線粒體基因突變與藥源性耳聾的關(guān)系研究的比較清楚，突變攜帶者就是藥源性耳聾的敏感個體。藥源性耳聾尚無有效治療方法，唯一的辦法就是預(yù)防。通過基因檢測，發(fā)現(xiàn)基因突變的攜帶者，盡早干預(yù)，可以預(yù)防藥源性耳聾的發(fā)生。

本試驗(yàn)采用特異引物延伸技術(shù)結(jié)合實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，通過PCR產(chǎn)物Tm值的差異來實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)突變的檢測，當(dāng)有突變型核酸存在的情況下，針對突變型設(shè)計(jì)的序列特異性引物得到延伸產(chǎn)生特定的PCR產(chǎn)物，同時在每個反應(yīng)體系中加入了熒光物質(zhì)，擴(kuò)增完成后，熒光物質(zhì)結(jié)合到PCR產(chǎn)物中，在進(jìn)行熔解曲線分析后，不同的PCR產(chǎn)物將產(chǎn)生不同的熔解峰（即熔解峰所對應(yīng)的溫度值不同），從而達(dá)到一個反應(yīng)同時檢測兩個突變的結(jié)果。所購買的試劑盒中未提供陽性對照，由該公司另行提供。為方便判斷C1494T和A1555G突變的熔解峰峰位，本試驗(yàn)將2個陽性標(biāo)準(zhǔn)對照分別檢測，發(fā)現(xiàn)1555G突變?nèi)劢夥宄霈F(xiàn)在75℃，1494T突變?nèi)劢夥宄霈F(xiàn)在78℃；結(jié)果圖1B中1555G熔解曲線除了出現(xiàn)特異性產(chǎn)物熔解峰外還出現(xiàn)了較多的雜峰，可能與該公司提供的標(biāo)準(zhǔn)對照濃度太低有關(guān)，但不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定。

對藥源性耳聾基因突變的檢測方法，除本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的方法外，還有直接測序法、實(shí)時熒光定量Taqman探針法、耳聾基因芯片法、酶切法等。直接測序法雖然是鑒定突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作繁瑣、需專門的培訓(xùn)，結(jié)果判讀復(fù)雜。Taqman探針法與本方法比較，雖然用的均為熒光定量PCR儀，但本法能在一管中實(shí)現(xiàn)兩個位點(diǎn)的檢測，成本低廉、結(jié)果判讀容易。目前芯片方法需要1次同時檢測9個常見耳聾基因突變位點(diǎn)，成本較高，不適合單獨(dú)針對藥源性耳聾患者的臨床篩查。酶切法雖然不需要用到熒光定量PCR儀，但操作較復(fù)雜，特異性差，需跑電泳（電泳膠需要額外配制，而且含致癌物質(zhì)），容易污染。本實(shí)驗(yàn)儀器要求簡單，費(fèi)用低，操作簡單，無需酶切或電泳，同時整個過程除加入模板外無需進(jìn)行開蓋操作，有效避免污染的產(chǎn)生，能夠簡單、快速、準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)2個點(diǎn)突變的同時檢測或單獨(dú)檢測。

[1]管敏鑫，邵敏華.線粒體基因的分子診斷：早期氨基糖苷類抗生素耳毒作用的發(fā)現(xiàn)與預(yù)防[J].中國優(yōu)生優(yōu)育，2008，14（1）：2-3.

[2]周永安，王湘，馬云霞，等.遺傳性非綜合征性常見耳聾基因診斷的研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2011，（19）7：27-30，39.

[3]林文津，郭舜民，張亞敏，等.聾病患者線粒體DNA突變檢測在指導(dǎo)家系成員氨基糖苷類藥物個體化使用中的應(yīng)用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2008，13（8）：918-921.

[4]Lu Y，Dai D，Chen Z，et al.Molecular screening of patients with nonsyndromic hearing loss from Nanjing city of China[J].J Biomed Res，2011，25（5）：309-318.

[5]李琦，方如平，黃德亮，等.新疆地區(qū)漢族和維吾爾族耳聾基因突變的比較研究[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010，24（1）：11-15.

[6]卜云飛，呂曉光，汪洋，等.22例非綜合征型耳聾患者的致病基因突變位點(diǎn)分析[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，30（3）：390-393.

[7]王莉娜，周世媛，常明秀，等.應(yīng)用基因芯片檢測線粒體突變耳聾家系報(bào)告[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2013，（1）：12，21.

[8]韓崇旭，任傳利，李貴玲，等.基因芯片法檢測21例耳聾患者基因突變的研究[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2012，18（1）：1-4，9.

[9]李海波，李瓊，李紅，等.非綜合征性聾突變熱點(diǎn)的流行病學(xué)分析[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2012，26（13）：589-594.

[10]魏紹煌，郭舜民，林文津.基因芯片法檢測自疑藥源性耳聾患者基因突變35例[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2011，16（7）：768-771.

[11]袁永一，黃德亮，韓東一，等.實(shí)時熒光定量Taqman探針法檢測線粒體DNA1494C＞T突變技術(shù)的建立及應(yīng)用研究[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志，2009，17（2）：180-182.

[12]周學(xué)軍，歐陽小梅，劉學(xué)忠.常見遺傳性聾致病基因研究進(jìn)展及基因診斷的臨床應(yīng)用[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志，2011，19（1）：73-77.

[13]要跟東，李守霞，張小芳，等.邯鄲地區(qū)健康體檢人群線粒體DNA A1555G和C1494T突變分析[J].中國婦幼保健，2013，28（6）：971-973.