應(yīng)用模糊集理論對(duì)壯肝逐瘀煎抗肝纖維化的優(yōu)化研究

王振常 柳 明 黃晶晶 呂建林

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科，廣西南寧 530023

壯肝逐瘀煎是在已故的全國(guó)有名老中醫(yī)林沛湘教授治療慢性肝炎、肝炎肝硬化有效驗(yàn)方的基礎(chǔ)上組方而成，經(jīng)過(guò)多年實(shí)踐其有效性不容置疑[1-4]，其經(jīng)驗(yàn)和理論的積累可能通過(guò)數(shù)十載而得來(lái)，理論的構(gòu)建是極其艱苦的，一旦建成如不能通過(guò)技術(shù)將其復(fù)制出來(lái)，推廣出去，將大大降低其價(jià)值及社會(huì)貢獻(xiàn)?，F(xiàn)代科學(xué)具有很強(qiáng)的推演體系，使其可以通過(guò)以現(xiàn)代技術(shù)為中介進(jìn)行大規(guī)模的推廣應(yīng)用。這里需要說(shuō)明的是，現(xiàn)代技術(shù)是一種具有很強(qiáng)的復(fù)制功能和很好的可重復(fù)性的手段[5]。本研究復(fù)制四氯化碳（CCl4）復(fù)合因素大鼠肝纖維化模型，以藥效模型為指標(biāo)，基于模糊集理論建立藥物與各功效指標(biāo)的數(shù)學(xué)模型，對(duì)方中各成分進(jìn)行量化控制，分析壯肝逐瘀煎中各藥物的重要性，去除方中冗余成分，使組方更科學(xué)、精確。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔SPF大鼠260只，雌雄各半，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK桂2010-0010。

1.2 藥物與試劑

壯肝逐瘀煎（黃芪45 g，牡蠣30 g，土鱉蟲(chóng)5 g，鱉甲30 g，黃精 20 g，枸杞 20 g，薏苡仁 45 g，橘紅 10 g，澤蘭 30 g，炒雞內(nèi)金 15 g，虎杖 20 g，大棗 15 g）由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，按等效劑量計(jì)算大鼠所需全方及拆方生藥量，經(jīng)浸泡、煎煮3次后、過(guò)濾及水浴蒸發(fā)制成每毫升含1 g生藥的水煎液（濃度100%）2000 mL藥液，高溫滅菌后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩４簏S蟄蟲(chóng)丸0.2 g/kg（廣東陽(yáng)江制藥廠有限公司，批號(hào)Z19991101），4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Cl4分析純購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、白介素（IL）-2、IL-6、IL-10 均為武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.3 編制因素位級(jí)表

壯肝逐瘀煎由12味藥物組成，分析方中各藥用藥與否的差別、藥物用量的差別、各藥物搭配的差別，故為12因素3位級(jí)，采用列表。見(jiàn)表1。

1.4 動(dòng)物分組

健康清潔級(jí)SPF大鼠260只，體重120～150 g，隨機(jī)取15只作為正常對(duì)照組（A組）。剩余大鼠進(jìn)行肝纖維化造模，于第4周末造模大鼠隨機(jī)處死5只，證實(shí)肝纖維化形成后，將其余造模大鼠隨機(jī)分為病理模型組（B組）、大黃蟄蟲(chóng)丸組（C組）、壯肝逐瘀煎配比1～28組，每組8只。

1.5 造模及給藥方法

采用韓德五等[6]報(bào)道的方法復(fù)制CCl4復(fù)合因素大鼠肝纖維化模型，為了防止肝臟自然修復(fù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響，各組于用藥開(kāi)始后仍每周注射40%CCl4油劑1.5 mL/kg 1次，A組除外。造模4周后各組分別予以壯肝逐瘀煎配比1～28組藥液、生理鹽水（A、B組），大黃蟄蟲(chóng)丸（C組）灌胃給藥，灌胃液體量為0.1 mL/kg，1次/d，其濃度及等效劑量按體表面積折算。

1.6 標(biāo)本制備

各組于用藥治療后4、8、12周，禁食12 h，隨機(jī)選取5只大鼠稱重，經(jīng)1%戊巴比妥麻醉，股靜脈采血后處死，剖取肝臟，取肝臟右葉相同部位組織1塊置入10%甲醛，作常規(guī)石醋切片，將余下肝臟組織于液氮中速凍，-196℃保存，以備勻漿測(cè)羥脯氨酸（HYP）、提取mRNA及RT-PCR分析用。血清于-70℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)錂z測(cè)。

表1 1～28組壯肝逐瘀顆粒配比情況（g）

1.7 觀察指標(biāo)及方法

①酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA法）測(cè)定血清IL-2、6、10及 TNF-α；②肝組織 HYP測(cè)定：李文才等[7]法依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算HYP含量；③大鼠肝組織過(guò)氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量，分別按MDA測(cè)定盒和SOD測(cè)定盒方法檢測(cè)；④采用半定量RT-PCR法分析肝組織MMP-1、2、3及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物（TIMP）-1、2的mRNA表達(dá)差異。取PCR產(chǎn)物和 PCR Markers各 10 μL，加緩沖液，瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外透射反射分析儀下觀察并攝像，圖像分析軟件分析電泳條帶條的面積和光密度，以平均值代表相應(yīng)基因的表達(dá)量，并除以相應(yīng)βactin的mRNA的平均值，即為MMP-1、2、3及TIMP-1、2的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組各指標(biāo)水平比較

各組 IL-2、6、10、TNF-α、肝組織 HYP、SOD、MDA水平，MMP-1、2、3 及 TIMP-1、2mRNA 水平表達(dá)及肝組織炎纖維化程度比較，分別見(jiàn)表2～4。

表2 各組 IL-2、6、10 及 TNF-α 水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組 IL-2、6、10 及 TNF-α 水平比較（pg/mL，±s）

注：IL-2：白介素-2；IL-6：白介素-6；IL-10：白介素-10；TNF-α：腫瘤壞死因子-α

ABC1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 170.9±17.3 130.8±12.5 140.7±12.2 141.1±14.3 150.5±13.5 158.9±18.9 143.2±12.9 142.9±16.9 138.9±13.6 138.4±19.0 136.8±14.1 142.2±23.8 135.7±17.3 169.2±18.9 175.5±12.6 148.2±23.4 144.7±20.7 139.2±15.5 137.2±11.2 139.6±17.2 133.2±14.8 132.8±11.3 153.2±19.6 146.5±15.6 155.3±21.3 142.7±22.0 138.2±19.2 149.7±25.3 135.3±16.9 134.2±14.2 139.9±17.4 62.2±16.4 97.6±12.5 89.9±6.5 86.7±6.5 70.9±18.9 75.3±16.1 68.1±13.7 87.5±7.1 86.4±10.1 87.0±7.7 86.5±8.1 87.1±8.7 88.5±6.7 66.9±14.5 76.4±18.7 67.1±19.5 86.0±10.6 86.0±11.0 88.0±5.7 86.3±10.2 87.2±7.6 86.7±9.6 65.9±19.3 64.6±18.7 68.7±15.0 86.9±11.3 89.2±3.0 88.6±7.6 88.6±7.1 93.3±5.8 90.1±10.1 139.6±9.2 29.3±10.3 37.1±13.2 42.4±23.3 113.7±11.3 112.3±13.4 119.2±10.7 72.4±28.2 41.2±20.6 45.4±16.1 37.9±15.3 47.8±21.0 46.3±24.3 130.7±13.0 114.2±8.4 58.6±20.2 110.3±15.7 45.7±24.6 44.9±24.9 37.2±18.1 47.2±25.0 53.9±32.2 131.3±17.4 107.1±15.1 110.0±10.4 45.0±24.1 32.0±5.9 45.1±19.9 50.1±25.2 45.7±19.7 38.9±12.7 15.5±2.3 39.6±5.4 35.5±4.2 31.3±5.6 28.8±6.0 28.5±7.2 26.0±6.6 28.0±8.0 28.3±7.4 26.0±5.6 25.5±5.5 26.0±8.2 23.9±6.4 22.7±3.8 23.9±2.2 28.6±5.7 25.7±6.8 28.8±4.2 28.2±5.6 28.8±3.4 27.3±6.4 29.5±7.3 25.3±7.2 26.5±8.5 26.1±9.2 28.9±6.2 23.7±7.1 26.6±6.0 26.3±7.3 26.2±6.9 27.1±8.6組別 IL-2 IL-6 IL-10 TNF-α

2.2 采用模糊集理論對(duì)中藥復(fù)方壯肝逐瘀煎抗肝纖維化的配伍規(guī)律進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)

2.2.1 指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化處理 為方便起見(jiàn)，用fj表示從表2開(kāi)始指標(biāo)依次排列位于第j位的指標(biāo)j=1，2…，12。首先將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)寫(xiě)成區(qū)間數(shù)，例如表2中第1組在指標(biāo) f1（IL-2）的指標(biāo)值（141.1±14.3）pg/mL 寫(xiě)成區(qū)間數(shù)a11=[aL11，aR11]=[126.8，155.4]；第 1 組在指標(biāo) f2（IL-6）的指標(biāo)值 （86.7±6.5）pg/mL 寫(xiě)成區(qū)間數(shù) a12=[a12L，a12R]=[80.2，93.2]；其余類似表達(dá)可得區(qū)間數(shù)的決策矩陣A=（aij）31×12，其中， i=A，B，0，1，2，…，28，分別表示 A、B、0、1、2、…、28 組，j=1,2…，12。 其次，12 個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)中有3個(gè)正向（極大型）指標(biāo)和9個(gè)逆向（極小型）指標(biāo)，為了消除不同物理量綱對(duì)決策結(jié)果的影響，采用如下“極差變換法”將區(qū)間數(shù)矩陣 A=（aij）31×12轉(zhuǎn)化為規(guī)范化的區(qū)間數(shù)矩陣 B=（bij）31×12[2]。

①對(duì)于正向（極大型）指標(biāo) fj（j=1，3，6），記 aRj=B，0，1，2，…，28。

表3 各組肝組織HYP、SOD、MDA的比較（±s）

表3 各組肝組織HYP、SOD、MDA的比較（±s）

注：HYP：羥脯氨酸；SOD：過(guò)氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

ABC1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 96.84±18.68 235.88±102.88 210.22±88.22 187.83±63.22 127.26±43.76 131.34±40.15 144.87±29.22 163.68±50.68 158.88±52.46 155.76±51.27 178.84±52.84 182.60±55.76 180.36±51.92 137.86±32..34 133.84±24.68 142.78±45.63 156.45±48.89 160.78±45.43 166.54±44.29 190.22±48.97 182.34±54.23 187.65±61.22 145.64±38.74 130.22±42.58 132.98±44.84 158.83±54.24 167.74±44.89 159.67±50.20 178.87±54.46 188.98±60.00 186.45±58.21 184.89±26.89 78.41±20.32 120.55±23.89 124.34±24.68 173.89±21.43 169.81±24.68 170.74±22.56 136.87±23.45 142.39±23.99 138.76±20.65 121.22±22.42 116.88±23.86 118.45±24.67 173.64±22.74 177.84±20.82 175.86±±21.87 133.24±20.24 146.43±22.35 142.26±23.84 124.98±20.33 115.34±28.43 120.32±23.22 180.21±20.75 169.55±29.71 176.78±24.12 138.34±21.36 143.38±23.65 148.83±22.47 122.21±20.33 106.89±22.65 139.86±23.57 41.82±17.26 156.85±33.84 148.81±39.66 146.59±32.21 118.42±33.68 121.57±32.58 122.78±34.42 142.66±42.32 139.68±32.34 135.74±40.29 152.24±34.67 142.37±36.74 144.34±32.71 120.45±34.25 118.27±33.48 122.57±36.45 138.67±42.45 140.24±41.33 133.68±43.93 148.65±35.74 152.46±33.85 150.49±34.47 126.87±38.32 128.36±35.21 120.22±33.49 139.74±43.57 143.64±39.87 141.44±34.74 146.48±38.87 144.29±33.87 140.23±35.45組別 HYP （μg/g） SOD （nU/mg） MDA （nmol/mg）

②對(duì)于逆向（極小型）指標(biāo)：fj（j=2，3，5，7，… ，12）， 記i=A，B，0，1，2，…，28。

經(jīng)過(guò)變換后所有的指標(biāo)都被轉(zhuǎn)化為正向 （極大型）指標(biāo)，且將規(guī)范化的區(qū)間數(shù)矩陣 B=（bij）31×12。

2.2.2 評(píng)價(jià)方法 （模型）——逼近理想點(diǎn)法 理想點(diǎn)法（technique for order preference by similarity to ideal solution，TOPSIS）是一種常用的有限方案多屬性決策分析法，同時(shí)也是一種有效的多指標(biāo)評(píng)價(jià)方法。其基本思想是：根據(jù)指標(biāo)性質(zhì)以各指標(biāo)的最優(yōu)值組成的有序數(shù)組作為正理想點(diǎn)，即理想方案，以各指標(biāo)的最劣值組成的有序數(shù)組作為負(fù)理想點(diǎn)，即負(fù)理想方案。然后計(jì)算各備選方案的各指標(biāo)值所組成的有序數(shù)組到正、負(fù)理想點(diǎn)的距離，以及各方案與理想方案的貼近度，依據(jù)各備選方案與理想方案的貼近度來(lái)判斷備選的優(yōu)劣[8-9]。

表4 各組大鼠肝組織中MMP-1、MMP-2、MMP-3及 TIMP-1、2 mRNA 表達(dá)水平（±s）

表4 各組大鼠肝組織中MMP-1、MMP-2、MMP-3及 TIMP-1、2 mRNA 表達(dá)水平（±s）

注：MMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶-1；MMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶-2；MMP-3：基質(zhì)金屬蛋白酶-3；TIMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1；TIMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-2

ABC1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 0.936±0.437 1.398±0.342 1.386±0.354 1.386±0.354 1.317±0.124 1.316±0.140 1.316±0.133 1.322±0.243 1.350±0.215 1.334±0.245 1.374±0.348 1.366±0.352 1.384±0.334 1.314±0.150 1.317±0.156 1.316±0.180 1.342±0.239 1.352±0.266 1.333±0.328 1.371±0.362 1.368±0.372 1.384±0.342 1.319±0.137 1.312±0.154 1.317±0.143 1.346±0.246 1.351±0.236 1.352±0.268 1.371±0.342 1.382±0.332 1.368±0.354 1.59±1.34 10.37±1.62 6.59±3.36 6.52±3.20 2.87±2.61 2.63±2.37 2.94±2.68 5.89±1.78 5.37±1.62 5.57±1.88 6.23±3.24 6.48±3.09 6.08±3.37 2.79±2.53 2.65±2.39 2.83±2.57 5.05±2.13 5.32±2.07 5.53±1.98 6.28±3.22 6.15±3.37 6.23±3.12 2.34±2.08 2.28±2.02 2.54±2.28 5.12±2.49 5.48±2.22 5.59±1.87 6.47±2.39 6.25±3.21 6.18±3.10 0.24±0.08 10.72±1.69 4.23±0.39 4.21±0.33 1.53±0.37 1.44±0.39 1.51±0.32 3.22±0.29 3.34±0.21 3.17±0.31 3.91±0.28 4.17±0.39 4.22±0.38 1.47±0.38 1.46±0.41 1.39±0.43 3.27±0.23 3.39±0.20 3.17±0.31 4.07±0.33 3.99±0.29 4.12±0.26 1.51±0.31 1.49±0.37 1.45±0.34 3.22±0.23 3.34±0.27 3.36±0.33 4.11±0.31 4.09±0.37 4.21±0.36 2.0632±0.1378 5.6246±0.5528 3.3367±0.2342 3.3367±0.2342 2.6402±0.2199 2.5411±0.1577 2.4321±0.2375 2.8188±0.3744 2.7752±0.3230 2.9789±0.3414 3.1122±0.2719 3.2791±0.3544 3.1309±0.2987 2.5788±0.2311 2.5672±0.2475 2.4677±0.2199 2.7899±0.3743 2.8932±0.3621 2.8798±0.3426 3.2101±0.2985 3.1397±0.3199 3.1307±0.3123 2.4372±0.3125 2.5712±0.2399 2.4589±0.2371 2.8818±0.3527 2.9122±0.3134 2.8174±0.3367 3.3124±0.2899 3.2879±0.3396 3.3343±0.3121 8.20±1.14 21.88±3.83 18.22±3.39 18.22±3.39 13.34±4.41 13.25±4.23 13.33±4.35 15.98±4.01 16.09±3.89 15.96±4.14 17.92±3.97 18.09±4.17 18.11±4.26 13.56±3.82 13.43±4.11 13.19±4.27 16.13±3.92 15.86±4.11 15.94±4.08 17.97±3.93 18.14±3.92 17.92±4.11 13.34±4.07 13.45±4.23 13.22±3.98 15.97±3.95 16.08±4.05 16.16±4.09 17.76±4.27 18.03±4.21 17.89±3.79組別 MMP-1 MMP-2 MMP-3 TIMP-1 TIMP-2

根據(jù)規(guī)范化的區(qū)間數(shù)矩陣 B=（bij）31×13可得：

正理想點(diǎn)為 b+=（b1+，b12+， …b12+）， 其中，bj+=[bLAj，1]，j=1，2…，12；

負(fù)理想點(diǎn)為 b-=（b1-，b2-，…b12-），其中 bj-=[0，bBJR]，j=1，2…，12。

根據(jù)兩區(qū)間數(shù) a=[aL，aR]與 b=[bL，bR]的距離公式可知第i組的各指標(biāo)值所組成的有序區(qū)間數(shù)組bi=（bi1，b12，…bi12)與正理想點(diǎn)b+=（b1+，b2+， … ，b12+)的距離為第i組的各指標(biāo)值所組成的有序區(qū)間數(shù)組 bi=（bi1，bi2，…，bi12）與負(fù)理想點(diǎn) b-=（b1-，b2-， …，b-12）的距離為

從而第i組的各指標(biāo)值所組成的有序區(qū)間數(shù)組ba=（bi1，bi2，…bi12）的貼近度[10]為 di=di+/（di++di-），i=0，1，2，…，28。

由于方案 bi=（bi1，bi2，…bi12）與正理想點(diǎn) b+=（1，1，…1）距離越小越優(yōu)，而與負(fù)理想點(diǎn) b-=（0，0，…，0）越大越優(yōu)。 方案 bi=（bi1，bi2，…，bi12）的貼近度越小，則此方案越優(yōu)。

3 討論

經(jīng)計(jì)算各組按貼近度由小到大排序得到各組優(yōu)劣排序結(jié)果為：11組＞12組＞20組＞22組＞3組＞21組＞4組＞2組＞13組＞14組＞25組＞5組＞7組＞23組＞15組＞6組＞16組＞24組＞10組＞9組＞28組＞26組＞8組＞17組＞18組＞19組＞1組＞27組＞0組。 因此，第11組（柔肝化纖顆粒）最優(yōu)，達(dá)到簡(jiǎn)化處方行為要素、增強(qiáng)藥效、降低成本的目的，其作用機(jī)制可以體現(xiàn)以下四個(gè)方面：①保護(hù)肝細(xì)胞，防止肝細(xì)胞變性壞死；②促進(jìn)肝內(nèi)膠原蛋白降解，加速纖維組織重吸收；③脂質(zhì)過(guò)氧化和抗脂質(zhì)過(guò)氧化；④調(diào)節(jié)機(jī)體各種免疫應(yīng)答。

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