葛花鳶尾苷的酸水解及其對乙醇脫氫酶激活作用的研究

胡玉濤，馬雙雙，劉 瑩，王 益，黃 文*

1江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，連云港 222006;2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

葛花異黃酮是葛花生長過程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，具有解酒保肝［1，2］、抗腫瘤［3］、抗炎［4］、抗氧化［5，6］、保護(hù)胃粘膜等生物活性。葛花異黃酮大部分以糖苷形式存在，研究發(fā)現(xiàn)，游離型苷元的活性大大優(yōu)于結(jié)合型的糖苷［2］。鳶尾苷在葛花中的含量較高，是葛花異黃酮的代表性成分［7］，糖苷鍵的存在妨礙了其活性的發(fā)揮。異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化為異黃酮苷元的方法主要有酸水解法、堿水解法、酶水解法、Smith降解等方法［8］。鳶尾苷為含碳-氧的葡萄糖衍生物，在酸性水溶液中較易水解，酸解過程如圖1所示，酸解反應(yīng)體系簡單，產(chǎn)物易于分離，利于鳶尾苷元的純化。本研究以葛花中鳶尾苷為反應(yīng)底物，通過單因素和正交試驗(yàn)確定其酸水解的工藝條件，并分析鳶尾苷、鳶尾苷元體外對乙醇脫氫酶(ADH)的抑制效果，為葛花異黃酮水解工藝的研究和得到高活性的鳶尾苷元提供理論基礎(chǔ)。

圖1 鳶尾苷元的酸水解反應(yīng)［(A)鳶尾苷;(B)鳶尾苷元］Fig.1 Acid hydrolysis of tectoridin(A)to produce tectorigenin(B)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛花:采于湖北恩施，經(jīng)江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院鑒定為豆科植物野葛［Pueraria lobata(Willd.)Ohwi］的干燥花蕾。晾干、粉碎成60目，密封置陰涼處保存;葛根素標(biāo)品(含量大于99%)購于中國藥品生物制品檢定所;乙醇脫氫酶(ADH)購于Sigma Chemical Co(Germany)。

1.2 儀器與設(shè)備

Seven easy型pH計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司;高效液相色譜儀，日本島津公司;RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鳶尾苷的制備工藝［9］

取葛花100 g置于三頸瓶中，加入溶劑1∶1(v/v)n-正丁醇相/水1000 mL，在浸取溫度為70°C的條件下回流提取1.5 h。浸取液過濾后靜置平衡，分出正丁醇相。將過濾得到的正丁醇相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到100 mL，濃縮相在室溫下放置12 h，得到異黃酮的冷卻結(jié)晶，過濾干燥得粗產(chǎn)品。干燥的粗產(chǎn)品采用甲醇重結(jié)晶，得到粗產(chǎn)品的晶體。自然晾干，待用。

1.3.2 鳶尾苷的酸水解工藝

準(zhǔn)確稱取5 mg鳶尾苷晶體，加入密閉避光的水解管中，加入一定量的甲醇和鹽酸溶液，超聲處理10 min，充分混合均勻后于恒溫水浴鍋中水解。

1.3.3 鳶尾苷元的精制

按照1.3.2方法反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)后的水解液進(jìn)行減壓濃縮回收甲醇，冷卻，水解液用乙酸乙酯萃取兩次，蒸餾水水洗乙酸乙酯萃取液至pH檢測為中性，無水硫酸鈉脫水，回收乙酸乙酯，甲醇重結(jié)晶，得淡黃色針狀的鳶尾苷元結(jié)晶，備用。

1.3.4 鳶尾苷水解率的測定

1.3.4.1 HPLC 檢測條件

色譜柱:Hypersil BDS(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:甲醇-水(40∶60);檢測波長:265 nm;流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

1.3.4.2 鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取在60℃真空干燥至恒重的鳶尾苷對照品2.4 mg，置10 mL容量瓶中，70%乙醇溶解并定容至10 mL，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，作為對照品溶液(每1 mL含鳶尾苷0.24 mg)。以2、4、6、8、10 μL 依次進(jìn)樣，測定峰面積，以峰面積(μv*s)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=(5E+06)X+355733，R2=1。

1.3.4.3 鳶尾苷水解率的測定

將水解液用70%的乙醇定容至25 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾后待測。

A1:水解后鳶尾苷含量;A2:水解前鳶尾苷含量。

1.3.5 鳶尾苷、鳶尾苷元對乙醇脫氫酶(ADH)的激活作用

將1.5 mL 32 mM的焦磷酸鈉緩沖液(pH 8.8)，1.0 mL 27 mM NADH 溶液，0.5 mL 11.5%(v/v)乙醇，0.1 mL 0.1 mg/mL 葛花異黃酮溶液混勻，25 ℃溫育5 min 后，加入0.1 mL ADH(0.64 μg/mL)明膠溶液。對照組用0.1 mL蒸餾水代替葛花異黃酮溶液，其余操作相同。立即在340 nm波長下，每隔10 s讀數(shù)一次，連續(xù)測定5 min。取NADH濃度曲線的線性部分來計(jì)算NADH生成量。

式中:V為總反應(yīng)液的體積(mL);DF為稀釋倍數(shù);6.22為NADH在340 nm波長下的毫摩爾消光系數(shù);0.1為酶液的體積(mL)。

2 結(jié)果與分析

酸水解反應(yīng)主要受到酸水解溫度、酸水解時間、鹽酸濃度、固液比、甲醇濃度等因素的影響，本實(shí)驗(yàn)分別分析了不同因素對鳶尾苷水解效果的影響。

2.1 酸水解溫度對鳶尾苷水解率的影響

測定在不同酸水解溫度(50、60、70、80、90 ℃)條件下鳶尾苷水解率的變化，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同酸解溫度對水解率的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis rate

由圖2可知，溫度對鳶尾苷水解率的影響十分顯著，其水解率隨著水解溫度的增加逐步提高。當(dāng)溫度較低時(50、60℃)，鳶尾苷的水解率＜20%;當(dāng)溫度為70℃時，約有50%以上的鳶尾苷發(fā)生了水解;當(dāng)溫度達(dá)到80℃時，大部分的鳶尾苷都水解為鳶尾苷元(90% ＜水解率≤100%)。因此選擇80℃為最佳溫度。

2.2 酸水解時間對鳶尾苷水解率的影響

本文測定了在不同酸水解時間(3、4、5、6、7 h)條件下鳶尾苷水解率的變化，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同酸水解時間對水解率的影響Fig.3 Effect of time on hydrolysis rate

由圖3可知，在2 h到4 h之間，反應(yīng)時間對水解率的影響較為顯著，鳶尾苷的水解率隨反應(yīng)時間的延長而呈上升趨勢。水解4 h后，反應(yīng)時間的延長對水解率的影響不再明顯，水解率曲線趨向平緩，鳶尾苷已經(jīng)基本水解完全，出于成本和安全性考慮，選擇4 h為最佳水解時間。

2.3 鹽酸濃度對鳶尾苷水解率的影響

本文測定了在不同鹽酸濃度(3%、4%、5%、6%、7%)條件下鳶尾苷水解率的變化，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同鹽酸濃度對水解率的影響Fig.4 Effect of concentration of hydrochloric acid on hydrolysis rate

由圖4可知，隨著鹽酸濃度的增加，鳶尾苷的水解率逐漸增大。當(dāng)鹽酸濃度增加到5%時，鳶尾苷水解率為72.77%，之后水解率的增加不再明顯，由此判斷5%為最佳鹽酸濃度。

2.4 甲醇濃度對鳶尾苷水解率的影響

本文測定了在不同甲醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%)條件下鳶尾苷水解率的變化，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同甲醇濃度對水解率的影響Fig.5 Effect of concentration of methanol on hydrolysis rate

由圖5可知，隨著甲醇濃度的升高，鳶尾苷水解率逐漸下降，推斷原因可能是由于在固液比一定的情況下，甲醇濃度越高，則鹽酸含量越少，二者相互制約，而鹽酸含量為主要影響因素，所以水解率越低。鑒于此，在單因素實(shí)驗(yàn)時考慮不把甲醇濃度的選擇包括在內(nèi)，而在正交優(yōu)化時固定甲醇濃度考慮鹽酸濃度對水解效果的影響。

2.5 固液比對鳶尾苷水解率的影響

本文測定了在不同固液比(mg:mL)(2∶1、4∶5、1∶1、4∶3、1∶2)條件下鳶尾苷水解率的變化，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同固液比對水解率的影響Fig.6 Effect of liquid-solid ratio on hydrolysis rate

由圖6可知，改變固液比對鳶尾苷水解率的影響不大，從提高產(chǎn)率和節(jié)約成本的角度出發(fā)，選擇2∶1作為固液比。

2.6 鳶尾苷酸水解最佳工藝優(yōu)化

為了進(jìn)一步確定反應(yīng)的最優(yōu)條件以及影響因素的主次，選取酸解溫度、酸解時間和鹽酸濃度三個因素進(jìn)行三因素四水平的正交試驗(yàn)來優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素水平和結(jié)果分別如表1和表2所示。

表1 酸解正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for acid hydrolysis

表2 酸解正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test designs and results for acid hydrolysis

以鳶尾苷水解率為指標(biāo)進(jìn)行極差分析(表2)可知，影響鳶尾苷酸解效率因素的主次順序?yàn)?A(溫度)＞B(時間)＞C(鹽酸濃度)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)溫度較低時，延長水解時間，增加鹽酸濃度都會提高水解效率。但當(dāng)溫度較高時，延長時間，增加鹽酸濃度易導(dǎo)致苷元分解，失去活性。故優(yōu)化后確定酸解條件為A3B4C2，即溫度80℃，酸解5 h，鹽酸濃度4%，此時，鳶尾苷水解完全。

2.7 鳶尾苷酸水解前后的HPLC圖譜分析

將酸水解反應(yīng)前后的水溶液分別用70%的乙醇定容至25 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾后，進(jìn)樣10 μL檢測酸水解前后鳶尾苷HPLC圖譜的變化，結(jié)果如圖7所示。

圖7 酸解前后鳶尾苷的HPLC圖譜［(a):酸解前;(b):酸解后］Fig.7 HPLC chromatograms of tectoridin before(a)and after(b)acid hydrolysis

圖7(a)和(b)分別是水解前鳶尾苷和水解后產(chǎn)物的HPLC圖譜，鳶尾苷的保留時間在6 min左右，鳶尾苷元的保留時間在25 min左右。由圖(a)和圖(b)可以看出，酸水解前，樣品中以鳶尾苷為主要成分。在酸解反應(yīng)結(jié)束后，鳶尾苷的峰幾乎消失，出現(xiàn)鳶尾苷元的峰，并且鳶尾苷元為主要物質(zhì)。對比圖7(a)、(b)以及文獻(xiàn)報道，可以確定鳶尾苷已被酸水解生成鳶尾苷元，水解率可達(dá)99%以上。

2.8 鳶尾苷、鳶尾苷元對乙醇脫氫酶的激活作用

人體內(nèi)的乙醇脫氫酶活性越大，血液中的乙醇含量越低，進(jìn)而起到解酒護(hù)肝的功效。分別測定鳶尾苷和鳶尾苷元晶體對乙醇脫氫酶的激活率，其結(jié)果如表3所示。

由表3可知，鳶尾苷、鳶尾苷元均表現(xiàn)出一定的對乙醇脫氫酶的激活作用，并且鳶尾苷元對乙醇脫氫酶的激活作用大于鳶尾苷。

3 結(jié)論

本文以從葛花中分離得到的異黃酮類化合物鳶尾苷單體為反應(yīng)底物經(jīng)酸水解反應(yīng)得到鳶尾苷元，

表3 鳶尾苷、鳶尾苷元對ADH的體外激活作用Table 3 Effect of tectoridin and tectorigenin on ADH in vitro

通過單因素和正交試驗(yàn)，確定最佳反應(yīng)條件為:固液比1∶1(mg:mL)，甲醇濃度50%，反應(yīng)溫度80℃，反應(yīng)時間5 h，鹽酸濃度4%，該條件下鳶尾苷可以完全水解，水解后得到的鳶尾苷元純度為91.63%，產(chǎn)率為99.16%。通過對乙醇脫氫酶的激活作用實(shí)驗(yàn)，確定鳶尾苷元的激活率(132.35%)大于鳶尾苷(127.35%)，表明酸解可以提高葛花異黃酮類物質(zhì)的生物利用率，提高一直以來作為廢棄物處理的葛花的利用價值。

1 Han YO，Han MJ，Park SH，et al.Protective effects of kakkalide from flos puerariae on ethanol-induced lethality and hepatic injury are dependent on its biotransformation by human intestinal microflora.J Pharm Sci，2003，93:331-336.

2 Tsuchihashi R，Kodera M，Sakamoto S，et al.Microbial transformation and bioactivation of isoflavones from Pueraria flowers by human intestinal bacterial strains.Nat Med，2009，63:254-260.

3 Thelen P，Scharf JG，Burfeind P，et al.Tectorigenin and other phytochenicalsextracted from leopard lily Belamcanda chinensis affect new and established targets for therapies in prostate cancer.Carcinogenesis，2005，26:1360-1367.

4 Kim YP，Yamada M，Lim SS，et al.Inhibition by tectorigenin and tectoridin of prostaglandin E2 production and cyclooxygenase-2 induction in rat peritoneal macrophages.Biochim Biophys Acta，1999，1438:399-407.

5 Lee KT，Sohn C，Kim DH，et al.Hypoglycemic and hypolipidemic effects of tectorigenin and kaikasaponinⅢin the streptozotocin-induced diabetic rat and their antioxidant activity in vitro.Arch Pharm Res，2000，23:461-466.

6 Jung SH，Lee YS，Lim SS，et al.Antioxidant activities of isoflavones from the rhizomes of Belamcanda chinensis on carbon tetrachloride-induced hepatic injury in rats.Arch.Pharm.Res，2004，27:184-188.

7 Kim C，Shin S，Ha H，et al.Study of substance changes in flowers of Pueraria thunbergiana.Benth during storage.Arch Pharm Res，2003，26:210-213.

8 Ghosh P，F(xiàn)enner GP.Improved method for gas chromatographic analysis of genistein and daidzein from soybean(glycine max)seeds.J Agric Food Chem，1999，47:3455-3456.9 Xu HN，Huang WN，He CH.Modeling for extraction of isoflavones from stem of Pueraria lobata(Willd.)Ohwi using nbutanol/water two-phase solvent system.Sep Pur Tech，2008，62:590-595.